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ELISAでの相互作用確認 トピック削除
No.13112-TOPIC - 2025/09/17 (水) 20:27:41 - 九州
あるタンパク質A,B[Bは検出用にヒト抗体のIgGをつけてます]を培養細胞で分泌させて、培養上清を用いて相互作用をELISAで見ようとしています。
（培養上清は、無血清）

Aをひく
↓
Blocking(5% Skimmilk 溶媒は、0.1% Tween/TBS)
↓Wash x3
Bを供する
↓Wash x3
ヒト抗体IgGを認識するHRP付きの抗体
↓Wash x4
基質反応

でアッセイしてますが、上手く見れません。

具体的には、シグナル強度のネガコンとの差がはっきり見えません。

結合することは知られているので、似たような系で結合を見ている先行研究を見ると、Wash bufferとして、0.05% Tween/PBSを用いていました。
現在私は、0.1% Tween/TBSを用いています。

これは、Wash bufferを変えると上手くいく可能性はあるでしょうか？
相互作用自体は、あまり強い分子ではなさそうです。

一応、他にはタンパク質を濃縮することも考えています。

経験等あれば、ご教授していただけますと幸いです。
　
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(無題) 削除/引用
No.13112-6 - 2025/09/18 (木) 11:26:48 - 774R
たとえば糖鎖修飾のされ方の違いで結合性に影響がある可能性は？
発現させる細胞によって違ってくることも。

(無題) 削除/引用
No.13112-5 - 2025/09/18 (木) 10:46:21 - 九州
>[Re:3] おおさんは書きました :
> >[Re:1] 九州さんは書きました :
> > あるタンパク質A,B[Bは検出用にヒト抗体のIgGをつけてます]を培養細胞で分泌させて、培養上清を用いて相互作用をELISAで見ようとしています。
> > （培養上清は、無血清）
>
> IgGをつけているってどう言うじょうたいですかね。抗体が結合する事により結合部位が隠れてたりしませんかね。

一応、Fcを付与できるようなベクターに組み込んで、分泌させてます。
先行研究でも、Fc融合タンパク質で見ている例もあるため、結合に対する影響は少ないと考えています。

> > 具体的には、シグナル強度のネガコンとの差がはっきり見えません。
> >
> > 結合することは知られているので、似たような系で結合を見ている先行研究を見ると、Wash bufferとして、0.05% Tween/PBSを用いていました。
> > 現在私は、0.1% Tween/TBSを用いています。
> >
> 先行研究は同じタンパクですか？
>
>
同じタンパク質です。

(無題) 削除/引用
No.13112-4 - 2025/09/18 (木) 10:44:16 - 九州
>[Re:2] みさんは書きました :
> 可能性があるかないかと言われたら皆あると答える
> やってみたらええがな
>


そうですよね、、やってみます

(無題) 削除/引用
No.13112-3 - 2025/09/17 (水) 23:57:49 - おお
>[Re:1] 九州さんは書きました :
> あるタンパク質A,B[Bは検出用にヒト抗体のIgGをつけてます]を培養細胞で分泌させて、培養上清を用いて相互作用をELISAで見ようとしています。
> （培養上清は、無血清）

IgGをつけているってどう言うじょうたいですかね。抗体が結合する事により結合部位が隠れてたりしませんかね。
>
> 具体的には、シグナル強度のネガコンとの差がはっきり見えません。
>
> 結合することは知られているので、似たような系で結合を見ている先行研究を見ると、Wash bufferとして、0.05% Tween/PBSを用いていました。
> 現在私は、0.1% Tween/TBSを用いています。
>
先行研究は同じタンパクですか？

(無題) 削除/引用
No.13112-2 - 2025/09/17 (水) 20:50:33 - み
可能性があるかないかと言われたら皆あると答える
やってみたらええがな

ELISAでの相互作用確認 削除/引用
No.13112-1 - 2025/09/17 (水) 20:27:41 - 九州
あるタンパク質A,B[Bは検出用にヒト抗体のIgGをつけてます]を培養細胞で分泌させて、培養上清を用いて相互作用をELISAで見ようとしています。
（培養上清は、無血清）

Aをひく
↓
Blocking(5% Skimmilk 溶媒は、0.1% Tween/TBS)
↓Wash x3
Bを供する
↓Wash x3
ヒト抗体IgGを認識するHRP付きの抗体
↓Wash x4
基質反応

でアッセイしてますが、上手く見れません。

具体的には、シグナル強度のネガコンとの差がはっきり見えません。

結合することは知られているので、似たような系で結合を見ている先行研究を見ると、Wash bufferとして、0.05% Tween/PBSを用いていました。
現在私は、0.1% Tween/TBSを用いています。

これは、Wash bufferを変えると上手くいく可能性はあるでしょうか？
相互作用自体は、あまり強い分子ではなさそうです。

一応、他にはタンパク質を濃縮することも考えています。

経験等あれば、ご教授していただけますと幸いです。
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