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(無題) 削除/引用 No.13144-23 - 2025/10/18 (土) 05:42:36 - おお >[Re:18] えきさんは書きました : > 多くの皆様にご助言いただき感謝致します。 > 今はこんな感じで進めています。 > ・細胞はHelaを使用しているが、HEK293Tも今後使用予定。 > ・トランスフェクション試薬はFuGENE HDを使用。 HelaやHEK293TならFuGENE HDでかなりいい導入効率が得られると思います（私の経験上）。

(無題) 削除/引用 No.13144-22 - 2025/10/18 (土) 05:38:38 - おお ２９３T細胞などT antigenが発現する細胞にSV40 oriをもつプラスミドを導入するとトランジェントには複製により細胞内のプラスミドコピー数が爆増し非常に強い発現が見込めます。導入後、薬剤処理を続けた場合、安定導入株が取れます。先に示した文献ではSV40 oriとT antigenの組み合わせは細胞内でのエピソーマルでのプラスミドの維持に好ましくないとされていますが（私の見てきた情報の限りで、うまく維持できるやり方もあるかもしれません）、ゲノムにも取り込まれるのでそれによる発現は維持されるものだと思ってます。しかしその状態であまり良くないことが起こる可能性も指摘されています。たしかInvitrogenの何かの商品のProduct sheetかなにかに、SV40 oriがゲノムにインテグレートされることにより、染色体の不安定化が促進されるので好ましくないと書かれていました。そういう状態では細胞にとって何らかの形で増殖抑制がかかるような遺伝子を導入した場合、ゲノムの不安定化によりそういう好ましくない遺伝子が排除される可能性が考えられます。そうでなくても細胞がどんどん変わっていくと思うとちょっと気持ちが悪いですね。 しかしながら２９３T細胞にSV40 oriをもつプラスミドを安定導入して実験している報告も見られますので、やったらだめな方法とは言いませんし、そのへんの判断はお任せすることにします。

(無題) 削除/引用 No.13144-21 - 2025/10/18 (土) 04:58:34 - おお >[Re:20] ハチさんは書きました : > > まってるのですけどね。 > > 待ちきれないように憶測に基づいたコメント合戦を控えてはということを申し上げました。 > 色々と情報を加えているだけで、その中で質問者が必要な情報を拾えばいいと私は思ってます。複数の人で話し合いをすると普通そういう状況になりませんか？Discussionに慣れてらっしゃらないのでは？また質問と関係ない話でも質問者が知らないのであればそれは質問者によっても有用でしょう。 それに必ずしも返答が返ってくると限りませんから、その場合は色々な角度の色々な情報があったほうがいいですし、質問者はそれらの情報をみて本人的には解決している可能性もあります。 また情報という観点では色々な視点のものが書き込まれて残ることがいい情報ソースになると思います。

(無題) 削除/引用 No.13144-20 - 2025/10/17 (金) 22:59:35 - ハチ > まってるのですけどね。 待ちきれないように憶測に基づいたコメント合戦を控えてはということを申し上げました。

(無題) 削除/引用 No.13144-19 - 2025/10/17 (金) 20:40:56 - 774 情報ありがとうございます。一般的な安定発現細胞の樹立ですね。HeLa, 293Tあたりならどの試薬でも大丈夫だと思います。確率を上げようとするなら、目的遺伝子と薬剤耐性遺伝子の発言に影響のないサイトで切断して直鎖状にしておくと、ランダムな直鎖化よりは効率がいいと聞いた覚えがあります。 目的遺伝子が細胞死や増殖抑制を誘導しないという前提ですが、安定発現細胞が取れるかどうかは、前回指摘したような要因で左右されるでしょう。 ちょっと気になるのは293Tはneo耐性なので、G418でのselectionに関しては賛否が分かれるところです。私は避ける派です。

(無題) 削除/引用 No.13144-18 - 2025/10/17 (金) 18:40:02 - えき 多くの皆様にご助言いただき感謝致します。 今はこんな感じで進めています。 ・細胞はHelaを使用しているが、HEK293Tも今後使用予定。 ・トランスフェクション試薬はFuGENE HDを使用。 ・G418でセレクション中。 ・細胞内ゲノムに組み込まれる安定的トランスフェクションを目指している。 一過性のKDはこれまでやってきているのですが、長期間〜恒常的な導入はこれが初めてです。 曖昧な表現になり、すみませんでした。

(無題) 削除/引用 No.13144-17 - 2025/10/17 (金) 15:21:55 - ぽいう 質問者が経験的に分かってないため、どう追加コメントすればいいかもわからなくなってるに一票

(無題) 削除/引用 No.13144-16 - 2025/10/17 (金) 09:55:15 - おお >みなさんがお使いの試薬でトランスフェクションにおすすめの試薬 細胞によるので使う細胞を明記されたほうがいいと思います（できないかもしれませんが）。リポフェクタミン２０００とか３０００、Fugene HD、４Kなどはよく使うCell lineではほぼOKだと思います。また使用例とその効率などもメーカーがリストにしてたりしますので探してみてください。他にも各社出してますが、あまり使用したことがないので、、、リン酸カルシウムやPEI系は結構細胞を選ぶと思いますが、使っている人も多いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.13144-15 - 2025/10/17 (金) 09:47:26 - おお >[Re:13] ハチさんは書きました : > トピ主さんの真意をそれぞれに推測してコメント合戦をするより、まずは追加コメントを待ちませんか？（ありがち） まってるのですけどね。

(無題) 削除/引用 No.13144-14 - 2025/10/17 (金) 09:18:28 - cvbn 今やっている実験の具体的なプロセスと、今どこの段階なのかを明示したほうがいいです。（単に抗生剤でセレクションかけて生き残った細胞を培養してるところなのか、クローニングまでした後なのかなど）それがないと皆さん答えようがないと思うので。

(無題) 削除/引用 No.13144-13 - 2025/10/17 (金) 07:46:11 - ハチ トピ主さんの真意をそれぞれに推測してコメント合戦をするより、まずは追加コメントを待ちませんか？（ありがち）

(無題) 削除/引用 No.13144-12 - 2025/10/17 (金) 06:53:36 - おお https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0165111089900237 SV40 oriとEBV oriPの比較をやってますね。

(無題) 削除/引用 No.13144-11 - 2025/10/17 (金) 01:28:19 - たこ ものすごく簡単に。 限界希釈なりでクローニングしたものですが、十年以上高発現しているものもあれば、クローニング後にストックするまでの間にどんどん消えていくものもある。 ものによるとしかいえないし、そうとしか思っていない。 774さんのおっしゃるようにインテグレートされる場所なり、サイレンシングがかかりやすいとか、入ったクローンによっても当然違うでしょうから。 あとは導入した遺伝子の機能にもよるし。

(無題) 削除/引用 No.13144-10 - 2025/10/16 (木) 19:22:56 - asan エピソーマルなままoriを加えて維持されるかと言う話であれば、293TとかT antigenがある細胞でSV40oriのプラスミドでためせばいいでしょうが、一般的には染色体にインテグレートされなければ不安定なので抜け落ちると言われてます。 ＞環状のプラスミドをトランスフェクションして、薬剤選択をすればずっと発現し続けるか？と聞いている気がするのは私だけ？ 「発現し続ける」と意味が曖昧ですが、通常は薬剤セレクションマーカー薬剤セレクションマーカーだけ出てる細胞をとっても意味がないので耐性マーカーと一緒に入れたGene of Interestがで続けるかという意味と考えるのが自然でしょう。 答えは、クローン化すると決して少なくない数で発現してない細胞は存在する、と言うことです。経験上そうだったので、個人的にはクローン化する方が無難だと思ってます。 強制的にウイルスの原理を用いてインテグレートさせるレンチウイルス/レトロウイルスによる方法の場合は効率の関係で耐性マーカーが出てる細胞はほぼ100%目的の領域ごと組み込まれます。

(無題) 削除/引用 No.13144-9 - 2025/10/16 (木) 18:05:07 - おお 発現が維持されるかどうかはYes&Noです。細胞増殖という観点で細胞の生理状態を乱す様なものだと、薬剤耐性だけど発現の弱いものが徐々にドミナントになってきます。

(無題) 削除/引用 No.13144-8 - 2025/10/16 (木) 17:58:52 - おお プラスミドの状態で維持するにはoriとそれを制御するタンパク質が必要で、EB virus oriとEBNA1遺伝子を持つプラスミドが挙げられると思う。自己複製し分裂後も維持される。ただ維持している間に全くインテグレーションされてないかと言うとそう断言は出来ない。SV40oriとT Antigenの組み合わせもプラスミドが複製するが、あまり長期的維持には向いてなく、どうもインテグレーションが起こった細胞がドミナントになる様です。

(無題) 削除/引用 No.13144-7 - 2025/10/16 (木) 17:44:52 - 774R 質問者が経験的に分かってない可能性を棄却できませんでした。

(無題) 削除/引用 No.13144-6 - 2025/10/16 (木) 17:43:44 - おお >[Re:4] ぽいうさんは書きました : > 環状のプラスミドをトランスフェクションして、薬剤選択をすればずっと発現し続けるか？と聞いている気がするのは私だけ？ 薬剤選択でゲノムにインテグレーションされるのが経験的にわかっているので、特にい答えに違和感はないです。

(無題) 削除/引用 No.13144-5 - 2025/10/16 (木) 17:27:28 - 774R ですね。 「このプラスミドの発現は導入後もずっと安定している」 と書かれてるので、プラスミドの状態で安定維持されるかを問うてるように思います。

(無題) 削除/引用 No.13144-4 - 2025/10/16 (木) 14:56:03 - ぽいう 環状のプラスミドをトランスフェクションして、薬剤選択をすればずっと発現し続けるか？と聞いている気がするのは私だけ？

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