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(無題) 削除/引用 No.13146-14 - 2025/10/25 (土) 02:10:02 - おお >[Re:13] KKさんは書きました : > 皆様 > > ご回答いただき誠にありがとうございました． > > 早速分注して高速遠心する方法と低速長時間遠心で比較してみました． > フィードバックありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.13146-13 - 2025/10/24 (金) 06:20:30 - KK 皆様 ご回答いただき誠にありがとうございました． 早速分注して高速遠心する方法と低速長時間遠心で比較してみました． 一方は溶出時に2mLtube に分注し，isopropanolを添加したあとに13,000xg, 30min, 4℃　遠心しSupをdiscard, 75%EtOH を加えて，13,000xg, 10min, 4℃　でペレット化したもの．　 もう一方は50mL遠心管のまま,4,000xg，1hour, 4℃　遠心，Supをdiscard, 75%EtOH を加えて4,000xg, 30min, 4℃　でペレット化したもの． どちらもTEで溶解，Nanodropで確認しました． 結果としては，分注して高速遠心したもののほうが1.5~2倍近い量を得ることができました．２サンプルずつ行ったのですが，こちらのほうがブレも少なかったです． プラスミドにもよるかとは思いますが，上記の結果を踏まえまして，今後は分注して高速遠心で行っていこうと思います． 改めまして，ご協力いただき誠にありがとうございました．

(無題) 削除/引用 No.13146-12 - 2025/10/22 (水) 05:04:02 - KK >おお様 早速ご返信いただきありがとうございます． エタノールの前なのですね．どうしても取れないときにはこの方法も活用させていただきます． 私事ですが，英語圏のラボなのでPIとのコミュニケーションも完璧ではなく，不安が多い状態でした．その中でご相談に乗っていただきまして，誠にありがたい限りです．

(無題) 削除/引用 No.13146-11 - 2025/10/22 (水) 04:29:14 - おお >MgCl2を添加する方法というのもあるのですね．ちなみにどの段階で加えるのでしょうか？ エタノール（プロパノール）を加える前です。この方法は短いオリゴなどで沈殿促進に使われたりします。

(無題) 削除/引用 No.13146-10 - 2025/10/22 (水) 02:55:59 - KK 皆様 早速ご回答いただきまして，誠にありがとうございます． 非常に勉強になっております． >774R様，AA様　のおっしゃるように，小分けに分注して高速遠心するというのはシンプルながらに盲点でした． 確かにしっかりと取れるときでもペレットはゆるめです． >おお様 様々にご指摘いただきありがとうございます． MgCl2を添加する方法というのもあるのですね．ちなみにどの段階で加えるのでしょうか？ エタノールでの沈殿は，以前のラボから７５％を使用していますが，ここで問題を感じたことはありませんでした． >gdtms様 低速の場合には，長時間の遠心が必要そうですね． >キアゲン様 現在行っているプラスミドの分子量が小さいのもあって，収量が安定しないのかもしれません． 皆様のご意見を踏まえて，分注する方法と低速長時間の遠心でまずは比較してみたいと思います． 誠にありがとうございます． 他にも追加事項などありましたら，ご指摘いただけましたら嬉しいです．

(無題) 削除/引用 No.13146-9 - 2025/10/21 (火) 13:43:57 - 774R > 774Rさんのおっしゃるように2 mLチューブ12本に分けるのが早いと思います。 これに関して追加すると、通常15mlで溶出しますが、これはカラムなので最初の1mlは前のウォッシュ用バッファーしか出てこないのでplasmidが含まれてません。また最後の2mlも薄くてほとんど回収する必要はありません。計12mlで済みます。 溶出液(12ml)に0.7倍のイソプロ（8.4ml)の合計20.4mlになるので、ちょっと無理して2ml tube x10本で行けます。 まあ、10本でもメンドクサイと思うかもしれませんが、最後にDNAをTEに懸濁する時、通常の50mlだとペレットが大きくなるため結構時間が掛かりますが、2mlずつだと早く溶けるメリットもあります。低いGで長時間遠心する必要もなくなるし、私がその状況なら2ml tubeでやると思います。

(無題) 削除/引用 No.13146-8 - 2025/10/21 (火) 12:41:31 - AA 同じように中容量の遠心機がないラボにいたとき、2mlチューブに分けてやっていました。意外と問題は生じませんでした。 他にはイソプロで遠心をしないキットを使うてもあります。 タカラが売っているマッハライナーゲルのNucleobondは最後のステップをメンブレンで行うバージョンがあり、集菌以外で遠心機を使わずに済みます。 QIAGENということで、おそらくプラスミドを使う側からの指定だと思いますが、エンドトキシンフリーのものもありますし事情を説明すれば認めてくれるのではという気はします。

(無題) 削除/引用 No.13146-7 - 2025/10/21 (火) 11:55:17 - キアゲン イソプロ沈殿の大きさはプラスミドの濃度によります。Maxiだとプラスミドによっては目に見える糸くずのような沈殿が見えることもあるので、そのような場合には低速かつ短時間の遠心で十分ですが、そうでないならもっと時間を伸ばすべきだと思います。 それで解決しないようであれば、774Rさんのおっしゃるように2 mLチューブ12本に分けるのが早いと思います。

(無題) 削除/引用 No.13146-6 - 2025/10/21 (火) 09:48:06 - gdtm カラムから溶出したサンプルは計測していて安定しており、イソプロ沈殿の収率が安定していないということでしょうか。 プロトコルを見たところ遠心は5000×g, 60minと記載されているので、60min以上やるべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.13146-5 - 2025/10/21 (火) 07:44:59 - おお >[Re:2] 774Rさんは書きました : > ペレットも緩くロスしそう。 ペレットが緩いとき、そこから剥がれてしまったとき、剥がれるおそれがあるときは、ピペットですって四分の一ほどを残し、７０％エタノールを加えて沈殿をよりタイトにして遠心、上清を捨て、もう一度７０％エタノールを加えるという手はあります。なんなら７５％ぐらいのエタノールでもいいかと思います（高濃度にするほど脱水が進むので良くないという意見もありますが、私はあまり問題を感じたことがありません）。 すでに指摘があるようにもちろん高速のほうがいいので（７０００g以上）、近くのラボにそれぐらいで（あるいはそれ以上で）遠心できる遠心機がないか探してみるのも手だと思います。

(無題) 削除/引用 No.13146-4 - 2025/10/21 (火) 06:15:57 - おお もし本当に遠心の問題なら、あとはプラスミドの用途を邪魔しないキャリアーを入れるとか。 Maxiですることはないのでそういうのがあるかどうかわからんけど。

(無題) 削除/引用 No.13146-3 - 2025/10/21 (火) 04:28:51 - おお お示しの遠心力で安定してそん色ない収量を得ているラボテクニシャンがいました。本当に遠心が原因か確認してみてもいいかと。 時間は長い方がベターです。 裏技的にはMgCl2を2mMぐらい加えた状態で遠心すると言うのもありますが、夾雑物も増えるかも知れません。TEで溶解後もう一度エタチンすれば幾らか除けるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.13146-2 - 2025/10/21 (火) 03:49:35 - 774R 4000gでは小さな沈殿物は落ちなさそうだし、ペレットも緩くロスしそう。 他のラボに借りることもできないなら2mlチューブに小分けして遠心するしかない。

Plasmid のMaxiprep の遠心に関して 削除/引用 No.13146-1 - 2025/10/21 (火) 00:59:18 - KK いつもお世話になっております． 最近ラボでプラスミドの精製を行っており，mini prep では問題なく収量が確保できるました． しかしQiagen Maxiprepでの抽出を依頼されましたところ，ラボには50mLtubeを高回転できる遠心機がないため，isopropanol 添加時と70%Ethanol添加時の遠心を4000xg, 4℃, 30min で行っています． この条件で，最終収量が安定しないことが多いのですが，PIに伺ってもこれでうまく行くはずだと言われ，リピートするのみになっています． このような場合には，どのようにすればよいのか（遠心の時間を伸ばすなど）のご教示をいただけたらと存じます． どうぞよろしくお願いいたします．

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