>[Re:1] shotaさんは書きました :
> となるベクターを使用して、発現する蛋白の途中の17アミノ酸（51bpの塩基配列）を50種類の配列に差し替えて、50種類のタンパクを発現させたいです。
> ベクターの作成法においては、ゴールデンゲート（Golden Gate / GG）法を考えているですが、以下の二つについて教えてください。
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> １，インサートする配列は、51bp+前後のBsaI/BsmBI の認識配列だけでいいのか。それとも効率を考えて、インサートする配列は200bp以上の長さにすべきか（この場合、変化させない130bp前後は、配列はそのままにします。）教えてください。インサートする配列が200bpと長すぎると外注での塩基配列の作成の値段が上がるのも懸念点です。
インサートの長さを長くしたほうが効率がいいと言う理屈が分かりません。一般的には短いほうが入りやすいです。NEB のデザインツールを見ると酵素の認識配列の外側に６ベース延長している様です。自身で確認してみてください。
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> ２，セレクション法はlacZやccdBをもとのベクターの差し替える前の配列に入れると良いみたいですが、lacZとccdBはどちらがおすすめですか。
個人的には必要性を感じません。大腸菌株の選択肢も狭まりますし。ccdB は特に誘導させてない状態のリークでも大腸菌に悪さしてそうでどうかなあと思うことがあります。そもそもターゲットのタンパクの途中をいれかえるのですよね？LacZとか途中に入れちゃうってことですか？
発現系も何を使ってるのか分からないし、大腸菌で発現させるの？
デザインをもう少し詳しく書いてもらえれば具体的な事を指摘できますが、ちょっと良く分からないことが多いい。 |
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