BioTechnicalフォーラム [タンパク質サンプルがカラムから溶出されない]

タンパク質サンプルがカラムから溶出されない

No.13160-TOPIC - 2025/11/14 (金) 11:12:15 - HH

質問失礼いたします。タンパク質の精製において、HPLC及びFPLCを用いた精製を行っています。その際、サンプルをカラムに打つとサンプルが溶出されません。おそらく、主要タンパク質は複数あり、すべてレクチン様タンパクだと考えられています。等電点はexpasyだと8.5～9.2、protein solだと9.2～10.2となっていました。以下にこれまで試した条件を示します。

・MONOSカラム、50mM HEPES(pH8.0)、50mM HEPES(pH8.0),2M NaCl
・MONOSカラム、50mM HEPES(pH7.0)、50mM HEPES(pH7.0),2M NaCl
・CM-5PW、25mM Tris-HCl(pH7.5)、25mM Tris-HCl(pH7.5),1M NaCl
・Superdex75 HiLoad prep grade、リン酸バッファー(pH7.0),0.15M NaCl
→少量の非吸着のみで他にはほぼノイズしか出てこなかった。

・Superdex75 HiLoad prep grade、リン酸バッファー(pH7.0),1M NaCl
→何種類かは別れたけど、最も多く含まれているはずのものが出てこなかった。また、分子量がバラバラに出てきた。

機器の不調も考えられましたが、既知サンプルだと正しく分離されましたので、その線は薄いと思います。
　

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No.13160-14 - 2025/11/15 (土) 22:57:03 - あの

一番最後の行は削除してください。

カラム容器への吸着ロスもあり得るので、カラムにゲルを詰めてから、ブロッキングした方が良いです。

(無題)

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No.13160-13 - 2025/11/15 (土) 22:54:48 - あの

そういう状況ですと、後の実験で問題がないタンパク溶液を、先に流して、カラム等への吸着ロスを減らすことを推奨します。

たとえば、BSAとかを。1mg/ml以上の濃い液にして、そのカラム体積の10%ぐらいの体積をカラムに通します。その後に、カラムへ、本番で使うものと同じ溶出液を、カラム体積の2倍ぐらい流して、BSAが、本番サンプルに混入する量を減らします。

なお、このブロッキングは、ゲルをカラムに詰める前でも良いです。

(無題)

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No.13160-12 - 2025/11/15 (土) 22:14:30 - HH

>[Re:10] 11さんは書きました :
> ２点ほど聞きます。
>
> フロースルーはチェックしてますか？カラムを素通りしてれば見たいものはそこにあると思う。なければくっついたまま出てこないのだと思う。フロースルーはプールして集めると希釈されてわからなくなるので、面倒でもA280モニターしながらフラクショネーションして回収し、フラクションごとにチェックした方がいい
>
→フロースルーもチェックしております。その画分をSDS-PAGEで確認すると、バンドはあるのですが、打ったサンプル量に対してはるかに少ない濃さのバンドしか確認できませんでした。

> サンプルはなんですか？　組織・細胞の抽出液？　培養上清？部分精製した画分？　サンプルの組成はどんな感じですか？(pHは？detergentや塩はどのくらい含まれてますか？)　ある程度平衡化bufferで希釈してアプライしてますか？
>
→サンプルは魚の皮膚抽出液です。それをTBS+でホモジナイズして、液を得ています。HPLCに打つ前にはバッファー交換を行い、打っています。

>[Re:8] みさんは書きました :
> 陽イオン交換にはリン酸やトリスはpHが高すぎて不向きじゃあないの？
> 酢酸ナトリウム、MES、クエン酸ナトリウムあたりのpH3-6あたりを使用するんじゃあなかったっけ？
> 分離したい蛋白のpIより低いpHじゃないとプラスに帯電せず、ちゃんと結合しなかったり、結果が安定しないんじゃあない？
> 知らんけど

→文献で、陽イオン交換は目的タンパク質のpiから1.0-2.0ほどpHが下であれば分離ができると読んだことがありました。そのため、サンプルの等電点はexpasyだと8.5～9.2、protein solだと9.2～10.2とのことから、このようなバッファーのpHを選択しました。

(無題)

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No.13160-11 - 2025/11/15 (土) 22:06:00 - HH

>[Re:9] あのさんは書きました :
> もしカラム使った経験の少ない初心者さんだったとして、ちょっとだけ意見を。
>
> もしロードしているタンパクが少ないと、タンパクのほとんどが、カラムに吸着トラップされて、出てこないけど、そのあたりは大丈夫ですか？

恥ずかしながら、今年の半ばから精製を行い始めました。カラムを外した状態でサンプルを打ってみて、ピークが振り切る直前までのサンプル量を元に、カラムをつけた際にはその5倍料のサンプルを打っています。タンパク質表的には1mg/mlほどです。

(無題)

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No.13160-10 - 2025/11/15 (土) 20:34:59 - 11

２点ほど聞きます。

フロースルーはチェックしてますか？カラムを素通りしてれば見たいものはそこにあると思う。なければくっついたまま出てこないのだと思う。フロースルーはプールして集めると希釈されてわからなくなるので、面倒でもA280モニターしながらフラクショネーションして回収し、フラクションごとにチェックした方がいい

サンプルはなんですか？　組織・細胞の抽出液？　培養上清？部分精製した画分？　サンプルの組成はどんな感じですか？(pHは？detergentや塩はどのくらい含まれてますか？)　ある程度平衡化bufferで希釈してアプライしてますか？

(無題)

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No.13160-9 - 2025/11/15 (土) 19:43:19 - あの

もしカラム使った経験の少ない初心者さんだったとして、ちょっとだけ意見を。

もしロードしているタンパクが少ないと、タンパクのほとんどが、カラムに吸着トラップされて、出てこないけど、そのあたりは大丈夫ですか？

(無題)

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No.13160-8 - 2025/11/15 (土) 17:54:17 - み

陽イオン交換にはリン酸やトリスはpHが高すぎて不向きじゃあないの？
酢酸ナトリウム、MES、クエン酸ナトリウムあたりのpH3-6あたりを使用するんじゃあなかったっけ？
分離したい蛋白のpIより低いpHじゃないとプラスに帯電せず、ちゃんと結合しなかったり、結果が安定しないんじゃあない？
知らんけど

(無題)

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No.13160-7 - 2025/11/15 (土) 17:01:06 - おお

>[Re:5] ＨＨさんは書きました :
> >[Re:3] おおさんは書きました :
> > >[Re:1] HHさんは書きました :
>
> →精製のファーストチョイスの一つとしてイオン交換を選びました。

あ、指摘したかったのは陰イオン交換の方がタンパクの分離に向いていると言う事です。

(無題)

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No.13160-6 - 2025/11/15 (土) 02:58:14 - おお

レクチンをセファでックスなどの支持体のゲルで精製している文献はありますので、そういうのを参照されてはどうでしょうか？支持体を変えてみるというのは一つの可能性としてありですが。

Jiang B, Wang X, Wang L, Lv X, Li D, Liu C, Feng Z. Two-Step Isolation, Purification, and Characterization of Lectin from Zihua Snap Bean (Phaseolus vulgaris) Seeds. Polymers (Basel). 2019 May 2;11(5):785. doi: 10.3390/polym11050785. PMID: 31052517; PMCID: PMC6571848.

Volume 12, Issue 4, 2023, 100
doi.org/10.33263/LIANBS124.100
Extraction and Purification of Lectin from Soybean Seeds (Glycine max)
Milind K. Velhal 1, Vikram S. Shenoy 2,*, Vijay Upadhye 3, Rajeshwar P. Sinha 4,*

Hou Y, Hou Y, Yanyan L, Qin G, Li J. Extraction and purification of a lectin from red kidney bean and preliminary immune function studies of the lectin and four Chinese herbal polysaccharides. J Biomed Biotechnol. 2010;2010:217342. doi: 10.1155/2010/217342. Epub 2010 Oct 3. PMID: 20976304; PMCID: PMC2952811.

>→NaClが入っていないバファーで平衡化を行い、NaClが入っているバファーでグラジエントをかけるプログラムで行っています。

ちょっとしたコツですが、全くNaClがないバッファーで平衡化するより、１０から１００mMとか若干の塩が入った状態のほうが分離がうまくいくという話があります。

(無題)

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No.13160-5 - 2025/11/14 (金) 16:20:38 - ＨＨ

>[Re:3] おおさんは書きました :
> >[Re:1] HHさんは書きました :
>
> >
> > ・MONOSカラム、50mM HEPES(pH8.0)、50mM HEPES(pH8.0),2M NaCl
> > ・MONOSカラム、50mM HEPES(pH7.0)、50mM HEPES(pH7.0),2M NaCl
> > ・CM-5PW、25mM Tris-HCl(pH7.5)、25mM Tris-HCl(pH7.5),1M NaCl
> 塩濃度が高いですけど、カラムに載せる前の平衡化もこのバッファーでしょうか？

→NaClが入っていないバファーで平衡化を行い、NaClが入っているバファーでグラジエントをかけるプログラムで行っています。

> 普通イオン交換は低塩濃度で吸着し、塩濃度を上げて溶出するのがたいていと思いますが。
> 最初から塩濃度が高いとくっつかないで分離されずに出てくる可能性が高いです。場合によっては高塩濃度のため支持体と疏水結合して落ちてこないて言う事もありえます。
> 別の話ですが陽イオン交換に着くタンパク質は結構限られていて、分離に役に立たないタンパクも多い様ですが、結合について何かすでにサポートするデーターがあるのでしょうか。

→精製のファーストチョイスの一つとしてイオン交換を選びました。結合についてのデータは特にないのですが、サンプルを打って溶出されなかった後に、0.2M NaOHでカラムを洗った際、巨大なピークが見られたため、吸着しているものだと考えました。

>
> > ・Superdex75 HiLoad prep grade、リン酸バッファー(pH7.0),0.15M NaCl
> > →少量の非吸着のみで他にはほぼノイズしか出てこなかった。
> >
> > ・Superdex75 HiLoad prep grade、リン酸バッファー(pH7.0),1M NaCl
> > →何種類かは別れたけど、最も多く含まれているはずのものが出てこなかった。また、分子量がバラバラに出てきた。
>
> 分子量がバラバラに出てきたと言うのがどう言う事なのかよく分かりません。幾らか塩濃度が高いほうが良さそうなら、NaClの代わりにLiClを使ってもいいかもしれません。LiClは疏水結合を切る作用があり、非特異吸着を幾らか防げる可能性が有ります。界面活性剤を入れても差し支えないのであれば塩の選択は必要ないかもしれません。しかしUVで吸収のあるデタージェントは検出の妨げになると言うのを考慮する必要があるし、イオン性のものは違う意味で使いにくい。
>
>
→おそらく、これはSuperdex75の担体がアガロース、デキストランのため、レクチン様タンパク質が化学相互作用で吸着し、何らかの理由で外れたのだと考察しておりました。

> >
> > 機器の不調も考えられましたが、既知サンプルだと正しく分離されましたので、その線は薄いと思います。
>
>

(無題)

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No.13160-4 - 2025/11/14 (金) 13:57:56 - おお

>[Re:2] totoさんは書きました :
> 目に見えない程度に凝集していていずれのカラムでもマトリクスの上に残ってる、というのが最初に考えることでしょうか。Superdexを６Ｍグアニジン塩酸で洗って出てくるならなそうでしょう。この場合は、抽出、以降の操作でdetergentやグリセロール等を加えれば改善できるかもしれません。

グアニジンはSDSPAGEする時SDSの沈殿が起こり流せないので私なら尿素を使います。

(無題)

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No.13160-3 - 2025/11/14 (金) 13:54:14 - おお

>[Re:1] HHさんは書きました :

>
> ・MONOSカラム、50mM HEPES(pH8.0)、50mM HEPES(pH8.0),2M NaCl
> ・MONOSカラム、50mM HEPES(pH7.0)、50mM HEPES(pH7.0),2M NaCl
> ・CM-5PW、25mM Tris-HCl(pH7.5)、25mM Tris-HCl(pH7.5),1M NaCl
塩濃度が高いですけど、カラムに載せる前の平衡化もこのバッファーでしょうか？
普通イオン交換は低塩濃度で吸着し、塩濃度を上げて溶出するのがたいていと思いますが。
最初から塩濃度が高いとくっつかないで分離されずに出てくる可能性が高いです。場合によっては高塩濃度のため支持体と疏水結合して落ちてこないて言う事もありえます。
別の話ですが陽イオン交換に着くタンパク質は結構限られていて、分離に役に立たないタンパクも多い様ですが、結合について何かすでにサポートするデーターがあるのでしょうか。

> ・Superdex75 HiLoad prep grade、リン酸バッファー(pH7.0),0.15M NaCl
> →少量の非吸着のみで他にはほぼノイズしか出てこなかった。
>
> ・Superdex75 HiLoad prep grade、リン酸バッファー(pH7.0),1M NaCl
> →何種類かは別れたけど、最も多く含まれているはずのものが出てこなかった。また、分子量がバラバラに出てきた。

分子量がバラバラに出てきたと言うのがどう言う事なのかよく分かりません。幾らか塩濃度が高いほうが良さそうなら、NaClの代わりにLiClを使ってもいいかもしれません。LiClは疏水結合を切る作用があり、非特異吸着を幾らか防げる可能性が有ります。界面活性剤を入れても差し支えないのであれば塩の選択は必要ないかもしれません。しかしUVで吸収のあるデタージェントは検出の妨げになると言うのを考慮する必要があるし、イオン性のものは違う意味で使いにくい。

>
> 機器の不調も考えられましたが、既知サンプルだと正しく分離されましたので、その線は薄いと思います。

(無題)

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No.13160-2 - 2025/11/14 (金) 12:58:20 - toto

目に見えない程度に凝集していていずれのカラムでもマトリクスの上に残ってる、というのが最初に考えることでしょうか。Superdexを６Ｍグアニジン塩酸で洗って出てくるならなそうでしょう。この場合は、抽出、以降の操作でdetergentやグリセロール等を加えれば改善できるかもしれません。

タンパク質サンプルがカラムから溶出されない

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No.13160-1 - 2025/11/14 (金) 11:12:15 - HH

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