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(無題) 削除/引用 No.13171-7 - 2025/12/02 (火) 14:58:28 - nr qq 様 N末のtagに関しては、Trxがリフォールディングを助けるのではという話があるため付けています。ただ、グアニジン塩酸塩で可溶化することを考えると無くてもいいのではと思い、ベクターの変更も検討しています。 抗体をリフォールディングで戻すことに関しては、自分の所属する研究室で様々な一本鎖抗体のリフォールディングや測定、結晶化などに成功しています。可溶性に出すことに比べると微妙かもしれませんが、リフォールディング自体はある程度できているのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.13171-6 - 2025/12/02 (火) 14:52:01 - nr December 様 不勉強で申し訳ないのですが、ストイキオメトリックかどうかというのはどういうことでしょうか？ RU値から求められる結合比は約1で、Konとkoffも他に扱っている抗体と大差なく、非特異的な結合も見られていません。(結合を観察している間のRU値が一定) 抗原側がコラーゲンであり、PBSなど中性バッファーではゲル状になってしまうため、ITC実験ができていません。そのため、結合比も確実な値が出せていません。

(無題) 削除/引用 No.13171-5 - 2025/12/01 (月) 20:23:29 - qq 逆質問ですみませんが、、、 一本鎖抗体を作ったことがないので教えてほしいのですが、N-末は裸にしておいたほうがいいんじゃないかと想像するのですが、そうでもないのでしょうか？ それと、リフォールディングでβシートだらけの抗体を戻すのは、ありなのでしょうか？（つまり、それで上手く言っているという報告がたくさんあるのかしら？）

(無題) 削除/引用 No.13171-4 - 2025/12/01 (月) 18:00:28 - December リフォールディングが不十分なんじゃないでしょうか。抗原との結合はストイキオメトリックですか。

(無題) 削除/引用 No.13171-3 - 2025/12/01 (月) 15:20:35 - nr qq 様 構成に関して、間違った内容で投稿していました。申し訳ありません。おっしゃる通り、Trx-H6-スロンビンサイト-targetになっており、目的タンパク質には終止コドンが入っています。 別の一本鎖抗体でも同じベクターを使用しており、そちらでは問題なくスロンビンによる切断が確認できています。Trxや6×Hisがエピトープとなっているのではということも考えていましたが、SPRでは抗原との結合が確認できたため、なぜ切れないのか不明です。

(無題) 削除/引用 No.13171-2 - 2025/11/30 (日) 19:08:20 - qq Trx-H6-ThrX-target-trailerになっていると思いますが、 targetの最後にストップコドンが入っていないと、trailerの中のH6を 読んでしまいます。 そうするとThrXを切断しても、target-H6になっている可能性があります。 あなたの話では、 ＞Hisの前にスロンビンサイトがあります。 とのことですが、Hisの直後にスロンビンサイトがあります。 そして、組み換えタンパクにストップコドンが入っていなのであれば、 その後ろにもH6/T6/P6のいずれかができると思います。

スロンビンによるtag切断 削除/引用 No.13171-1 - 2025/11/29 (土) 15:21:30 - nr 質問失礼します。 現在、一本鎖抗体を大腸菌系で発現させています。ベクターはpET32aで、6×HisとTrxがtagとして付いており、Hisの前にスロンビンサイトがあります。不溶性に出るため段階透析でリフォールディングした後にスロンビンで切断しようとしているのですが、tagが切れないだけでなく非特異的な切断が多く困っています。スロンビン切断サイトの配列は確認済みです。以前別の一本鎖抗体では上手くいっていたため、なぜtagが除去できないのかわかりません。助言を頂けると助かります。

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