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(無題) 削除/引用 No.13171-13 - 2025/12/13 (土) 11:59:23 - おお >[Re:12] nrさんは書きました : > おお　様 > 返信が遅くなり申し訳ありません。 > > > ＞リフォールディングについて > 急速に尿素を抜く方法のメリットを教えてくださりありがとうございます。ぜひやってみたいのですが、急速にというの尿素を4 Mから0 Mで一気に抜けばよいのでしょうか？ 論文など調べてみてはどうでしょうか？最終的には論文やレポートとしてまとめるときにリファフェンスが必要になるでしょうから。 https://jabonline.in/admin/php/uploads/937_pdf.pdf 2.1. Dilution Method ... The dilution method can be carried out with several approaches including reverse dilution, flash dilution, and pulse dilution. In reverse dilution, the refolding buffer is added to the dissolved protein where generally, the dilution is done by adding the dissolved protein to the refolding buffer. In flash dilution, dissolved protein is added to the refolding buffer with one addition. Whereas in pulse dilution, a number of dissolved proteins are added gradually into the refolding buffer at successive time intervals [8,16-19]. > > ＞on columnについて > カラム上で切断する場合、タンパク質溶液とスロンビンを混合してカラムに入れ、抗原カラム作製時の樹脂での抗原結合のように、カラムを振りながら反応させればいいでしょうか？全くやった事がないため想像ができず... 一例として https://cdn.cytivalifesciences.com/api/public/content/digi-11794-pdf 精製時にカラムに吸着させて、洗ってからカラムについた目的の蛋白を酵素処理するのが大抵です。精製して回収したものであればそれをカラムにつけてから、酵素溶液を加えればいいです。使用しているプラスミドの商品説明などに載ってませんか？ On columnでリフォールディングすればステップが減るでしょう。

(無題) 削除/引用 No.13171-12 - 2025/12/11 (木) 10:49:40 - nr おお　様 返信が遅くなり申し訳ありません。 ＞非特異的な切断 バンドを見たところ、大腸菌由来のバンドも薄くなっているため、スロンビンで切っている可能性はあると思いますが、完全に切れているわけではないようです。また、スロンビンは抜かずに電気泳動しているため、スロンビンのバンドは見えています。目的タンパク質のバンドも薄くはなっているのですが、正常な切断で見えるはずのバンドが見えていない状況です。 ＞リフォールディングについて 急速に尿素を抜く方法のメリットを教えてくださりありがとうございます。ぜひやってみたいのですが、急速にというの尿素を4 Mから0 Mで一気に抜けばよいのでしょうか？また、現在の透析は24時間でやっているのですが、時間も変えた方がいいでしょうか？ ＞on columnについて カラム上で切断する場合、タンパク質溶液とスロンビンを混合してカラムに入れ、抗原カラム作製時の樹脂での抗原結合のように、カラムを振りながら反応させればいいでしょうか？全くやった事がないため想像ができず... ＞CD測定について チオレドキシンの影響もあるので断言はできないのですが、抗体に多いβシートのスペクトルが確認できています。また、熱変性も50℃あたりに見えています。チオレドキシンの変性中点温度は調べた限りではとても高く(80℃など)、抗体部分が先に変性していることを示した結果ではないかと考えています。 変性中点温度を出すということでDSC測定も行ったのですが、こちらに関してはピークが出ていないため、結果のすり合わせができていません。CD測定と比べて濃度が高いため、チオレドキシンの熱安定性の影響が出ているのではと考えています。

(無題) 削除/引用 No.13171-11 - 2025/12/05 (金) 05:36:51 - おお 大腸菌の可溶画分に来るような工夫も並行して模索してもいいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.13171-10 - 2025/12/05 (金) 05:34:40 - おお >[Re:9] nrさんは書きました : > おお 様 > ＞スロンビンの認識サイトが内部の配列にある可能性 > これに関してはシーケンス解析から否定できています。 > > ＞非特異的な切断について > 切断前(リフォールディング後)には、恐らく大腸菌由来と思われるタンパク質が1種類残っていましたが、 それならその大腸菌由来の蛋白が切れている可能性もあるっちゃぁありますね。あくまでも可能性として。それとスロンビンが除けてなかったらそこからの持ち込みもあると思いますがどうでしょうか？ > > ＞リフォールディングについて > 希釈段階はより細かい方がいいのかと考えて2倍希釈でやっていたのですが、むしろ一気に尿素を抜いた方がいいのでしょうか？ 急速に希釈するやり方のメリットは分子同士の接触の機会を最小限に抑えて、アグリゲーションを防ぐというところです。 > > ＞On column On columnでは理想的には切れたものが溶出されますからね。 > > ＞リフォールディングを評価する方法 > 現在のところは、CDによる二次構造評価を行っています。抗原の可溶性の問題が解決すれば、ITCなどの結合能力評価も参考になると思われます。 > 今回のリフォールディングでその測定ではどういった結果でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.13171-9 - 2025/12/04 (木) 10:57:28 - nr おお 様 ＞スロンビンの認識サイトが内部の配列にある可能性 これに関してはシーケンス解析から否定できています。 ＞非特異的な切断について 切断前(リフォールディング後)には、恐らく大腸菌由来と思われるタンパク質が1種類残っていましたが、それ以外のタンパク質はSDS-PAGEで見える範囲では残っていません。また、スロンビン処理後では元々のtag付きタンパク質が5割ほど残っており、残りが様々な分子量の断片という感じでした。 ここも不思議な点なのですが、切断確認のためリフォールディング後のタンパク質溶液は熱処理しているのに正常な位置で切断できていませんでした(それもあって配列を確認したのですが、スロンビンサイトは正常でした)。 ＞リフォールディングについて リフォールディングは尿素の段階希釈で行っています。現在は4Mから2倍希釈していて、それぞれ24時間で透析しています。アルギニンの添加などで収量は上がっていますが、さらに改善できないか検討してみます。希釈段階はより細かい方がいいのかと考えて2倍希釈でやっていたのですが、むしろ一気に尿素を抜いた方がいいのでしょうか？ ＞On column tag付きタンパク質の精製はNiカラムで行っています。そのため、tag部分は露出していると考え、Niカラム精製前にスロンビンを添加していました。ですが、助言頂いたようにOn columnでより効率よく目的タンパク質を回収できる可能性は考えていなかったので、試してみます。 ＞リフォールディングを評価する方法 現在のところは、CDによる二次構造評価を行っています。抗原の可溶性の問題が解決すれば、ITCなどの結合能力評価も参考になると思われます。

(無題) 削除/引用 No.13171-8 - 2025/12/03 (水) 09:01:55 - おお そんなことはないかと思いますが、スロンビン認識部位が内部の配列に存在する可能性は否定できてますが？ 非特異的な切断とありますが、スロンビン切断前から存在している可能性はないですか？またその割合はどの程度ですか？ リフォールディングは尿素を使った方法もあります。改善する中で考慮するべきか考えてみてはどうですか（たしか尿素は急速に希釈する方法が相性良かったんだったっけ）？ On columnでのスロンビン処理をする余地はありませんか？ そのタンパク質においてリフォールディングを評価するすべはありますか？ スロンビンで切れないとなると、その部分が露出してないのではと思えます。ということはスロンビン切断部位が不適切な折りたたみや少数の分子間のアグリゲーションとかを想像してしまいます。そういう状態なら短いペプチドとかもそのアグリゲーションに取り込まれているかもしれません。その短い断片と思われるものが長いものとゲル濾過などで一緒の挙動を示すかなどである程度察しが付くでしょう。Hisなどのアフィニティーカラムに結合するならそのあたりはアクセスできるということなのでON Columnで切断するのは効率よくリフォールディングしたものを回収できる可能性も上がってくるでしょう。 また非特異な切断であるならば精製した蛋白にプロテアーゼが潜んでいる可能性もあると思います。 変性した状態でゲル濾過で分子量の揃ったものを得るとか、イオンクロマトでより精製度を上げておくとか言うのも改善の余地があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.13171-7 - 2025/12/02 (火) 14:58:28 - nr qq 様 N末のtagに関しては、Trxがリフォールディングを助けるのではという話があるため付けています。ただ、グアニジン塩酸塩で可溶化することを考えると無くてもいいのではと思い、ベクターの変更も検討しています。 抗体をリフォールディングで戻すことに関しては、自分の所属する研究室で様々な一本鎖抗体のリフォールディングや測定、結晶化などに成功しています。可溶性に出すことに比べると微妙かもしれませんが、リフォールディング自体はある程度できているのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.13171-6 - 2025/12/02 (火) 14:52:01 - nr December 様 不勉強で申し訳ないのですが、ストイキオメトリックかどうかというのはどういうことでしょうか？ RU値から求められる結合比は約1で、Konとkoffも他に扱っている抗体と大差なく、非特異的な結合も見られていません。(結合を観察している間のRU値が一定) 抗原側がコラーゲンであり、PBSなど中性バッファーではゲル状になってしまうため、ITC実験ができていません。そのため、結合比も確実な値が出せていません。

(無題) 削除/引用 No.13171-5 - 2025/12/01 (月) 20:23:29 - qq 逆質問ですみませんが、、、 一本鎖抗体を作ったことがないので教えてほしいのですが、N-末は裸にしておいたほうがいいんじゃないかと想像するのですが、そうでもないのでしょうか？ それと、リフォールディングでβシートだらけの抗体を戻すのは、ありなのでしょうか？（つまり、それで上手く言っているという報告がたくさんあるのかしら？）

(無題) 削除/引用 No.13171-4 - 2025/12/01 (月) 18:00:28 - December リフォールディングが不十分なんじゃないでしょうか。抗原との結合はストイキオメトリックですか。

(無題) 削除/引用 No.13171-3 - 2025/12/01 (月) 15:20:35 - nr qq 様 構成に関して、間違った内容で投稿していました。申し訳ありません。おっしゃる通り、Trx-H6-スロンビンサイト-targetになっており、目的タンパク質には終止コドンが入っています。 別の一本鎖抗体でも同じベクターを使用しており、そちらでは問題なくスロンビンによる切断が確認できています。Trxや6×Hisがエピトープとなっているのではということも考えていましたが、SPRでは抗原との結合が確認できたため、なぜ切れないのか不明です。

(無題) 削除/引用 No.13171-2 - 2025/11/30 (日) 19:08:20 - qq Trx-H6-ThrX-target-trailerになっていると思いますが、 targetの最後にストップコドンが入っていないと、trailerの中のH6を 読んでしまいます。 そうするとThrXを切断しても、target-H6になっている可能性があります。 あなたの話では、 ＞Hisの前にスロンビンサイトがあります。 とのことですが、Hisの直後にスロンビンサイトがあります。 そして、組み換えタンパクにストップコドンが入っていなのであれば、 その後ろにもH6/T6/P6のいずれかができると思います。

スロンビンによるtag切断 削除/引用 No.13171-1 - 2025/11/29 (土) 15:21:30 - nr 質問失礼します。 現在、一本鎖抗体を大腸菌系で発現させています。ベクターはpET32aで、6×HisとTrxがtagとして付いており、Hisの前にスロンビンサイトがあります。不溶性に出るため段階透析でリフォールディングした後にスロンビンで切断しようとしているのですが、tagが切れないだけでなく非特異的な切断が多く困っています。スロンビン切断サイトの配列は確認済みです。以前別の一本鎖抗体では上手くいっていたため、なぜtagが除去できないのかわかりません。助言を頂けると助かります。

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