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(無題) 削除/引用 No.13210-12 - 2026/02/11 (水) 03:09:47 - おお >[Re:11] イさんは書きました : > 皆様 > > たくさんのご指摘ありがとうございます。 > > おお様おっしゃるようにミトコンドリアβ酸化による活性酸素の発生との区別およびペルオキシソームβ酸化由来であることを明確にするためにミトコンドリアの関与を阻害することが目的です。 とおっしゃっている一方で >これまでペルオキシソームに関与することが知られていなかった別の試薬(研究の過程でその兆候が見えたもの)を使用したときに実際にβ酸化が亢進するのかということを見たいのです。その際にミトコンドリアのβ酸化の関与を排除する方法やカタラーゼの作用を考慮してH2O2産生を測定できる方法はないかと探しているというところです。 上記の別の試薬でペルオキシソームのH2O2が発生するのをみたいと書いてますが、どちらが目的ですか？ミトコンドリアのβ酸化を阻害する方法は論文を提示したと思いますが、、、そのうえでミトコンドリアはβ酸化以外に呼吸鎖からのH202の発生があると指摘してます。ミトコンドリアのβ酸化を阻害しても、そこを指摘されると思います。ペルオキシソームのACOX以外にもCOXがあるのでそこも否定する必要がありませんか？ > ペルオキシソームを単離すると、脂肪酸の供給などが完全に変わってしまうので、そこで得られた結果にケチが付きそうかなとも考えているのですがそこはどうでしょうか？ > 仮にカタラーゼ阻害剤などを使った場合は仮に論文化まで進んだ際に生理条件とはかけ離れすぎて系として破綻しているなどの指摘があるのではないかと思っています。これについてもご意見いただきたいです。 細胞や生体を使った実験で直接測れないというのはよくあることです。細胞内の基質になりうる脂質の測定、単離したペルオキシソームに脂質を添加したときのH2O2の発生量など多角的にアプローチしていくのは常套手段だと思います。よくわからないのですが、ペルオキシソームを単離したとき、その中に抱え込んだ基質があるなら迅速にH2O２を測ることはできませんか？カタラーゼの阻害剤を使うと生理的に、、、というのも、上記のように多角的なアプローチの一つとして考察していく一つのパーツになると考えればいいです。 もう一つ気になるのはACOXの活性があがるという仮説ですけど、活性は基質を反応させる能力で、基質に依存しないとも思えるのですが、それとも基質を含めた環境に置いてACOXが産生する産物、H2O2が増えるということを考えているのでしょうか？ > ACOXなど酵素活性が高くなっても＝H2O2産生も高くなるとは言えないのでHyper7-はPTS1に誘導させるのが良いように思っています。 私が言っているのはACOXにHyper7を融合しておけばACOXのFADH2から発生するH2O2がカタラーゼに消化される前に検知できる可能性（確率）が高くなるという考えからの考案です。ACOXのFADはFADH2になったあとACOXから外れるますか？はずれないなら、ACOXーFADH2を直接酸化する酵素があるのですか？その酵素はどんな反応でどんな反応物を生成しますか？

(無題) 削除/引用 No.13210-11 - 2026/02/10 (火) 09:33:36 - イ 皆様 たくさんのご指摘ありがとうございます。 おお様おっしゃるようにミトコンドリアβ酸化による活性酸素の発生との区別およびペルオキシソームβ酸化由来であることを明確にするためにミトコンドリアの関与を阻害することが目的です。 ペルオキシソームを単離すると、脂肪酸の供給などが完全に変わってしまうので、そこで得られた結果にケチが付きそうかなとも考えているのですがそこはどうでしょうか？ ACOXなど酵素活性が高くなっても＝H2O2産生も高くなるとは言えないのでHyper7-はPTS1に誘導させるのが良いように思っています。 仮にカタラーゼ阻害剤などを使った場合は仮に論文化まで進んだ際に生理条件とはかけ離れすぎて系として破綻しているなどの指摘があるのではないかと思っています。これについてもご意見いただきたいです。

(無題) 削除/引用 No.13210-10 - 2026/02/07 (土) 03:49:22 - おお >[Re:8] イさんは書きました : > おお様 > > ペルオキシソームのβ酸化阻害剤有無しの差でH2O2産生を見れるというのは理解しています。 > わたしが使おうとしている試薬は他のオルガネラに影響する可能性があるので単純に差分を見ただけでは判断できないと考えています。 > ペルオキシソームのβ酸化の他にミトコンドリアからのH2O2も増加させる可能性もあるので、、、 ミトコンドリアのベーター酸化は阻害しておく、パーオキシソームを単離するとか、解決方法を提示していますが。ミトコンドリアは呼吸鎖からの活性酸素発生もあるからそれを気にしているのでしょうか？ならばパーオキシソームを単離するという方法論に限られますね。カタラーゼは阻害できるかしら。アザイドなどヘムをターゲットにした阻害剤が有名ですが。 カタラーゼの影響を抑えるなら、ACOXに結合するタンパク質のモチーフとHyPer7＋PTS1（SKL）をつけたH2O2センサーを発現させておけばH2O2発生源近傍で検出できるのでいいかもしれません。ACOXにHyPer7を融合してもいいかもしれません。ACOX１、２、３がありますがどれがあなたの系でメインの発生源だと思いますか？ あとCOXも活性酸素発生源なのが気になりますね。

(無題) 削除/引用 No.13210-9 - 2026/02/06 (金) 21:23:32 - wedrftgy Pxにはcatalaseが大量に局在していますので、H2O2に対してはKmが大きいとはいえそれでもかなりの分は消去されるかもしれないですね。検出される活性酸素種の量は産生系と消去系のそれぞれの活性のバランスで決まるので、比較する場合、Catalase活性が同等という前提でないと困りますね。MitochondoriaのFAOと区別したいならばペルオキシソームを単離して実験すればPxのH2O2産生が測れるかもしれないですね。今はPxの単離kitも市販されてるみたいです。small scaleだと必要なPxの量を確保するのは大変かもしれないですが。in vitro系だと基質は超長鎖脂肪酸にカルニチン付けてアシルカルニチンにする必要があるかもしれないですね。この辺りはすでに先行研究があると思うので精査してみましょう。

(無題) 削除/引用 No.13210-8 - 2026/02/06 (金) 11:06:49 - イ おお様 ペルオキシソームのβ酸化阻害剤有無しの差でH2O2産生を見れるというのは理解しています。 わたしが使おうとしている試薬は他のオルガネラに影響する可能性があるので単純に差分を見ただけでは判断できないと考えています。 ペルオキシソームのβ酸化の他にミトコンドリアからのH2O2も増加させる可能性もあるので、、、 う様 カタラーゼ発現が高い細胞を想定しているので差が見えにくい可能性がありますが、一手法としてはありですね

(無題) 削除/引用 No.13210-7 - 2026/02/06 (金) 02:27:22 - おお >[Re:5] イさんは書きました : > おお様 > ペルオキシソーム阻害剤でどうこうするというよりは、これまでペルオキシソームに関与することが知られていなかった別の試薬(研究の過程でその兆候が見えたもの)を使用したときに実際にβ酸化が亢進するのかということを見たいのです。 申し上げていることがうまく伝わってない様に思います。 ペルオキシソームベーター酸化阻害剤ありとなしでH2O2量の差を取れば実際にペルオキシソームベーター酸化によるH2O2産生量がわかるのではないかと申し上げています。その別の試薬で処理したものとしてないもので上記のようにH2O2産生量を見積もればその試薬の効果が確認できませんか？ その試薬で処理後パーオキシソームを単離してH2O2を測ればもっと単純化できると思います。 カタラーゼも阻害しておく必要があるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.13210-6 - 2026/02/05 (木) 15:55:10 - う どんな細胞で、どんな設備があるのか全くわからず書きますけど、 HyPer7とかroGFP2-Orp1 のようなH2O2センサーにPTS1（SKL）を付けて ペルオキシソーム局在、ミトコンターゲティング配列でミトコンドリア局在、ただ発現させて細胞質させて観察すればよくない？

(無題) 削除/引用 No.13210-5 - 2026/02/05 (木) 12:54:22 - イ おお様 ペルオキシソームのβ酸化経路の各ステップにおいてステップ1で FADがFADH2になる際にH2O2が産生されると認識してます。ですのでβ酸化経路が亢進しているならばH2O2産生も増加していると考えました。 ペルオキシソーム阻害剤でどうこうするというよりは、これまでペルオキシソームに関与することが知られていなかった別の試薬(研究の過程でその兆候が見えたもの)を使用したときに実際にβ酸化が亢進するのかということを見たいのです。 その際にミトコンドリアのβ酸化の関与を排除する方法やカタラーゼの作用を考慮してH2O2産生を測定できる方法はないかと探しているというところです。

(無題) 削除/引用 No.13210-4 - 2026/02/05 (木) 04:07:28 - おお ペルオキシソームのベーター酸化によるH2O2産生量を測定したいということですか？最初の質問の印象とちょっと違いますね。 インヒビターをうまく利用して（前に示したミトコンドリアのベーター酸化阻害剤とか）H2O2を測るとかできそうなきがします。またはペルオキシソームのベーター酸化を特異的に阻害できるなら阻害剤あり、なしで差を取ればいいかもしれません（ミトコンドリアなどからのH2O2の生産量が多すぎないなら）。 https://www.scbt.com/ja/browse/acox2-inhibitors?srsltid=AfmBOoqkauGTSMBUHluiLE0w7XR4cBqns37pCHOyAA-ddU_OTxto9MtB 使えそうなのありますか？

(無題) 削除/引用 No.13210-3 - 2026/02/04 (水) 14:07:58 - イ おお様 ご意見ありがとうございます。 酵素活性については私も考えて上司に提案したのですが、酵素活性が高くなったからH2O2産生が上がっているという根拠にはならないということで却下されてしまいました。 お示しいただいた文献も参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.13210-2 - 2026/02/04 (水) 03:28:23 - おお H2O2は膜を透過しますのでミトコンドリア、ベルオキシソームなどで発生したH202は細胞質に発現しているカタラーゼで分解されます。実験で使われる細胞がミトコンドリアなど他の発生源のH2O2が無視できるような系（量が大きく違うとか）であればH2O2の測定で可能かと思われますが、そのような文献があるのでしょうか。 酵素活性などを図るという意味では１０から２０年年前から蛍光色素を使う方法がこの酵素に限らず色々と開発されてきています。 Uchinomiya S, Nagaura T, Weber M, Matsuo Y, Zenmyo N, Yoshida Y, Tsuruta A, Koyanagi S, Ohdo S, Matsunaga N, Ojida A. Fluorescence-Based Detection of Fatty Acid β-Oxidation in Cells and Tissues Using Quinone Methide-Releasing Probes. J Am Chem Soc. 2023 Apr 12;145(14):8248-8260. doi: 10.1021/jacs.3c02043. Epub 2023 Apr 3. PMID: 37011039. https://www.funakoshi.co.jp/exports_contents/81517 とここまで書いておいてFAO活性はミトコンドリアにもありますから、その区別がつかないですね。。。Peroxi_SPY555とかペルオキシソームマーカーと組み合わせれば区別がつくかもしれませんが、定量がどんどん難しくなってしまいますね。 Violante S, Achetib N, van Roermund CWT, Hagen J, Dodatko T, Vaz FM, Waterham HR, Chen H, Baes M, Yu C, Argmann CA, Houten SM. Peroxisomes can oxidize medium- and long-chain fatty acids through a pathway involving ABCD3 and HSD17B4. FASEB J. 2019 Mar;33(3):4355-4364. doi: 10.1096/fj.201801498R. Epub 2018 Dec 12. PMID: 30540494; PMCID: PMC6404569. こちらの文献ではミトコンドリアのFAO活性をインヒビターで抑制してペルオキシソームのFAOを見てますね。このような工夫が必要と思われます。 中途半端な回答になってしまいすいませんでした。

ペルオキシソーム 削除/引用 No.13210-1 - 2026/02/03 (火) 16:55:23 - イ 勉強させていただいてます。 ご経験ある方ご意見ちょうだいしたいですが、わたしは試薬を加えたときにペルオキシソームのβ酸化がどうなるかを研究してます。 β酸化が亢進しているかを測るためにH2O2産生レベルを見ようと思っているのですが、ミトコンドリアや細胞内全体のH2O2産生とペルオキシソームのみの産生レベルを区別する方法ありますか？ これをもしマウスで見るとなるとカタラーゼによる分解を避けられないため生体内で見るときのいいアイデアあれば教えてほしいです。 H2O2産生を見る以外にペルオキシソームのβ酸化を測定する良い方法あればそのご意見もお願いします。

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