組織量に対してlysis buffer が多すぎると希釈されてタンパク質濃度が低くなりすぎて後の実験で不都合が生じますので注意してください。目分量でもいいのですが大体,体積比で組織1に対してLysis buffer 10ないし20くらいがいい感じと思います。（もし濃度が高すぎたら後で希釈すれば良いので）
肝臓や脳など柔らかい組織は手でも十分ホモジナイズできます。心臓とか筋肉は硬いのであらかじめハサミで細切して凍結し、また小型の電動ホモジナイザーを使用した方がいいいです。組織の硬さに応じて選択してください。
組織は氷の上で解凍してからでなくて、凍結状態で良いので直ちにLysis buffer(プロテアーゼインヒビターを含む）に投入してください。小さい組織片ならば投入したらすぐに解凍しますので速やかにホモジナイズを始めてください。(ホモジナイズしながら解凍する感じ。) 組織が解凍する過程で細胞内の構造が崩壊していろいろなプロテアーゼが働き出しますのでここをいかにして手早くクリアするかは重要です。
Triton XやNP40など非イオン性界面活性剤がベースのlysis bufferでは可溶化できないタンパク質は割とあります。そうしたものはとりわけ核のタンパク質や細胞膜のタンパク質でしばしば見られます。使用する界面活性剤を変えることで可溶化できるタンパク質の種類や量も変わります。1~2%SDSなどの変性能の強いイオン性界面活性剤では、タンパク質の活性は失われますが、ほぼ全てのタンパク質を可溶化できます。研究対象とするタンパク質が今使用しているLysis bufferで十分に可溶化できるかどうかにも留意してください。
脳組織に専用の特別な方法は特にないともいます。他の組織と同様で良いと思います。 |
|
このスレッドをはてなブックマークに追加