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(無題) 削除/引用 No.13221-11 - 2026/03/02 (月) 08:34:29 - IF 良かった！

(無題) 削除/引用 No.13221-10 - 2026/02/28 (土) 10:31:10 - ライゲーションとInFusionのmix ご提案いただいたoverlap extention PCRで上手く行ったので報告します。 実は断片Aと断片Bの2つをIn-Fusionで入れる当初のデザインは、断片Bが短かく、In-Fusionがうまくいかない懸念もありました。 （あまりに短いとIn-Fusion反応で両端からの削り込みが出会ってしまい、2本鎖が乖離してしまう。） ということで、overlap extention PCRで断片Aと断片Bをまとめ上げることで一石二鳥でした。 ただ、2断片に分けてPCRをするのは結合部分に変異を入れることが目的だったので、万が一、元の鋳型がそのままPCRされたものが混入する可能性をできるだけへらすために、断片Aと断片Bを泳動→回収してからoverlap extentionに進みました。後で考えたら、DpnIで元の鋳型を分解するでもよかったかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.13221-9 - 2026/02/26 (木) 17:42:16 - ライゲーションとInFusionのmix IF様 ありがとうございます。 overlap extension PCRですね！ 何度かやったことあるのに思いつきませんでした。 でも、15bpのTm=47℃なのでなんとかイケる気がします。 両端のInFusion用プライマーは注文しちゃったけど、overlap extension PCRも並行してやってみます。

(無題) 削除/引用 No.13221-8 - 2026/02/26 (木) 15:45:33 - IF 15 bpがオーバーラップする断片を混合し、両末端のプライマーを使ってPCRすることで全長を増やせないだろうか？オーバーラップがもう少し長いといけそうな気がするけど。。

(無題) 削除/引用 No.13221-7 - 2026/02/26 (木) 14:10:12 - ライゲーションとInFusionのmix > お示しのようなインサート同士だけをinfusionとせず、全行程infusionでいいんじゃないでしょうか？ おっしゃるとおりその通りにしました。 いや、制限酵素サイトでクローニングする用のプライマーは既に持っていたので、ライゲーションとInFusionを組み合わせて出来ないかなと思ったまでです。 > Takara/Clontechがプライマーデザインツールも提供しているのでそちらからデザインされるといいんじゃないかと思います。 ツールがあるのですか。まあ単純なクローニングなので、使い慣れた遺伝子解析ソフトで15bpのoverlapを作って注文済みです。

(無題) 削除/引用 No.13221-6 - 2026/02/26 (木) 13:56:41 - AA ベクターを制限酵素で直鎖化＋インサートはPCR増幅、はinfusionの通常の使用法の一つです。 お示しのようなインサート同士だけをinfusionとせず、全行程infusionでいいんじゃないでしょうか？ Takara/Clontechがプライマーデザインツールも提供しているのでそちらからデザインされるといいんじゃないかと思います。 https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/primer-design-and-other-tools

(無題) 削除/引用 No.13221-5 - 2026/02/26 (木) 10:11:59 - ライゲーションとInFusionのmix > PCRで断片を作っているならシーケンスが必要ですよね。InFusionつかっても配列の確認は必要かと思いますし。 もちろんPCRしたインサート部分はシーケンス確認する予定です。 シーケンス範囲を減らすためにインサートのみPCRとしてベクター側は制限酵素で処理することにしました。 その制限酵素サイトに挿入するインサートの制限酵素サイト付加済みのPCRプライマーは既に持っているので、これを使えたらコストダウンになるという話です。 > InFusionは末端のDNAを削って一本鎖を露出させる方法なので。プラスミドに組み込む側も一本鎖が露出していると思います。ですからプラスミドを制限酵素処理をした場合でもそこに合うようにインサートの配列を作りフラグメントとプラスミドをInFusionで処理するのではなかったでしょうか？ そのとおりです。そして、今回はその方法に合うプライマーを新たに発注することにしました。

(無題) 削除/引用 No.13221-4 - 2026/02/26 (木) 09:55:54 - おお デザインが正確にわからないのですが、PCRで断片を作っているならシーケンスが必要ですよね。InFusionつかっても配列の確認は必要かと思いますし。 InFusionは末端のDNAを削って一本鎖を露出させる方法なので。プラスミドに組み込む側も一本鎖が露出していると思います。ですからプラスミドを制限酵素処理をした場合でもそこに合うようにインサートの配列を作りフラグメントとプラスミドをInFusionで処理するのではなかったでしょうか？ 理屈ではInfusion後クレノーなどで末端をフィルインしてから制限酵素処理をするというてはありますが、スッテップが多くなりすぎると効率も落ちてきてうまくいかなくなる可能性も大きくなります。また。InFusionで処理したからと言って加えたフラグメントすべてが加工されているわけでもありません。感覚的なラフな計算では混ぜたフラグメントの百分の一とか望むような反応をしていると言ってもいいかと思います。そのぐらいの量でもその１コピーが大腸菌入れば一つコロニーができますから。

(無題) 削除/引用 No.13221-3 - 2026/02/26 (木) 09:28:18 - ライゲーションとInFusionのmix 確かに、Infusion反応を先にやってしまうと片方の鎖が削れてligation不可能になるから、ligationを先に行って、その後でInFusion反応を行う必要があるのかな。 理論的には可能に見えるが、先に進めることが優先なのでプライマー再設計でインサートとベクターの間もInFusionにすることにしました。

(無題) 削除/引用 No.13221-2 - 2026/02/26 (木) 09:20:18 - やめたほうがいい 絶対に設計ミスも含めてめんどくさいことになるのでIDTで1塩基13円のプライマーを注文されることをお勧めします。

制限酵素noとInFusionの同時使用 削除/引用 No.13221-1 - 2026/02/26 (木) 09:12:09 - ライゲーションとInFusionのmix 経験のあるかたがいらっしゃいましたら教えてください。 PCRエラー確認のシーケンスとプライマー新規発注コストを無くすために以下のようなクローニングが出来ないか考えてます。 ベクターは制限酵素切断で調整。 インサートは2断片あり、それぞれPCRで作製。鋳型に変異を入れる都合で、2断片の合わせ目は15bp overlapにしてInFusionを使いたい。 この2断片の合体したものとベクターの間は制限酵素サイトでライゲーション。

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