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(無題) 削除/引用 No.13224-13 - 2026/03/07 (土) 13:27:05 - mRNA枠沈 なんなら、抗原をコードするmRNAをLNPで包んで、筋注すればいいんじゃないかな？ 皆さんは風邪の予防接種で打ちましたか？

(無題) 削除/引用 No.13224-12 - 2026/03/07 (土) 13:05:30 - we オーソドックスに大腸菌や培養細胞などで発現させたら封入体出来てしまいややこしそうな時は、無細胞系で蛋白質発現させるといいと、試薬の新製品広告か何か前に見たんだが。量的なことが気になるけど、最近はいいkitもいろいろでてるみたいで、そこそこの収量得られるみたいだし。ポリクロ作るにしてもウサギでなくてマウスやラットで作成すれば抗原量も少なくて済むし。

(無題) 削除/引用 No.13224-11 - 2026/03/07 (土) 10:33:45 - 774R 結局、やられてることは、モノクロならELISAでネイティブなタンパク質に結合するクローンを選択するとか、ポリクロならネイティブなタンパク質でアフィニティ精製するとかくらいですよね。

(無題) 削除/引用 No.13224-10 - 2026/03/07 (土) 02:00:14 - おお >[Re:9] 774Rさんは書きました : > 変性してないタンパク質で免疫しても、結局はペプチドに分解されて抗原提示されるのでタンパク質の構造の内部を認識する抗体も作られます。したがって、WBでは反応するけどIPやIFには使えないものも作られます。 構造を認識する抗体を作るにあたって効率的では全くないですもんね。何か効率を上げる工夫とかあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.13224-9 - 2026/03/06 (金) 22:13:25 - 774R 変性してないタンパク質で免疫しても、結局はペプチドに分解されて抗原提示されるのでタンパク質の構造の内部を認識する抗体も作られます。したがって、WBでは反応するけどIPやIFには使えないものも作られます。 たまたま立体構造依存的な抗体も出来るけど、免疫する抗原タンパク質のフォールディング状態を反映するかどうかって、都市伝説ではないかと思ってる。

(無題) 削除/引用 No.13224-8 - 2026/03/06 (金) 17:42:08 - ぽいう 多分ウサギでウエスタン用なのでしょうけど、ウサギなのかマウスやラットハムスターなのか、モノクロかポリクロか、ウエスタン用かFACSや免疫染色用かはせめて書いたほうが良い

(無題) 削除/引用 No.13224-7 - 2026/03/06 (金) 13:15:21 - zzrb 抗体の目的にもよりますね。 WBに用いるような抗体の作製が目的であれば変性タンパク質の状態で誘導を行っても良いと思います。 ですが、変性タンパク質で誘導したした抗体は天然の(正しくフォールディングした)タンパク質を認識しない可能性もあるので、そういった場合は注意が必要です。

(無題) 削除/引用 No.13224-6 - 2026/03/06 (金) 12:33:01 - we ポリクローナル抗体/抗血清を作成するとき、抗原が封入体などの場合、分子シャペロン関連タンパク質が結合してたりするので、免疫するとそういうものの抗体も一緒にできる可能性が大きい。なので抗原タンパク質をSDS-PAGEしてゲルから切り出したほうがそういう可能性を減らせるので良いかもしれない（それでもマイナーなきょう雑タンパク質はどうしてもあるので、目指す抗体が全然できなくて、そういうマイナーなきょう雑タンパク質に対する抗体がたくさんできたりすることも珍しくない。抗体のできやすさは必ずしも存在量に比例しない）。毛髪や動物の体毛、皮膚、器具に付着している微細なほこり、その他いろんなものに由来するケラチンに対する抗体ができることも免疫の回数が多くなるとよくあるので、基本的に抗原の準備や免疫する際はなるべくクリーンな機材、環境で作業したほうがいい。SDS-PAGE gelからバンドを切り出すならばガラス板は使用前に洗剤でよく洗うとか、染色液も再利用でなく事前に新調するとかも大事。ただ、いずれにせよもし関係ないタンパク質の抗体ができて非特異的反応が目立つような場合でも、抗原が穏和な条件できるならば抗原カラム作成して抗血清をaffinity精製すればほぼ解決できるけど。 ある程度お金かけられるならば、抗原性を予測して適切な部域の抗原ペプチドを合成して、キャリアタンパク質に結合させるところまでメーカーに委託でできるので、そうして作成した抗原を免疫する方法もあるし、最近はそのほうが主流と思う。こういうのはいろんなメーカーがよく受託のキャンペーンもやってるので利用するといい。うまくいけばポリクローナル抗体でもエピトープの明らかなモノスペシフィックな特異性の高い良い抗体が得られる。ただ成功率はケースバイケースで（経験だと50%くらい）、やってみないとわからない的なところがあるけど。もしIPや免疫染色を予定してる場合は抗原ペプチドとする配列部位によっては使えないことがあるのでその辺りも抗原ペプチド配列の設計段階で委託先と検討したほうがいい。 モノクローナル抗体を作成する目的なら、抗原の純度や性状はそれほど大きな問題にはならないと思う。

(無題) 削除/引用 No.13224-5 - 2026/03/05 (木) 13:56:44 - よっしー 私も774Rさんの意見と同じです． 封入体はほとんどが目的タンパク質だと思いますので，精製の必要もないような気がしますが，774Rさんが仰るようにSDS-PAGEからの切り出しで十分なような気がします．ゲルを細かく砕いてPBSで懸濁しアジュバントと一緒に動物に打つことも可能だと思います．

(無題) 削除/引用 No.13224-4 - 2026/03/05 (木) 04:33:31 - おお >[Re:3] おおさんは書きました : > > 場合によってはEDTAなどもあるかなと思う。 逆に金属イオン加えているものもあるみたいだね。Mg++ Ca++とかがまず思いつくと思いますが、蛋白によってはZnイオンとか盲点かも。

(無題) 削除/引用 No.13224-3 - 2026/03/05 (木) 00:58:04 - おお いろいろ文献を当たれば、ここでたまたま見かけた人の組成より幅広いバッファー組成が見つかると思うよ。 Roufarshbaf M, Akbari V. Development of Solubilization and Refolding Buffers. Methods Mol Biol. 2023;2617:155-164. doi: 10.1007/978-1-0716-2930-7_10. PMID: 36656522. Solis-Andrade KI, Gonzalez-Ortega O, Govea-Alonso DO, Comas-Garcia M, Rosales-Mendoza S. Production and Purification of LTB-RBD: A Potential Antigen for Mucosal Vaccine Development against SARS-CoV-2. Vaccines (Basel). 2022 Oct 20;10(10):1759. doi: 10.3390/vaccines10101759. PMID: 36298624; PMCID: PMC9609574. Manissorn J, Tonsomboon K, Wangkanont K, Thongnuek P. Effects of Chemical Additives in Refolding Buffer on Recombinant Human BMP-2 Dimerization and the Bioactivity on SaOS-2 Osteoblasts. ACS Omega. 2023 Jan 8;8(2):2065-2076. doi: 10.1021/acsomega.2c05802. PMID: 36687022; PMCID: PMC9850730. キットとかもあるね。 https://athenaes.com/protein-refolding.html https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/89867 加えれそうなものはデタージェント、シュークロース、場合によってはEDTAなどもあるかなと思う。 個人的には蛋白によって最適な条件は違うだろうから色々と検討して良さげなものを絞っていくしかないと思う。これまで使われなかったものが有効だったりするケースもあるし。ある蛋白はニッケルカラムで溶出バッファーにHisが入っていてその状態で活性があったが、抜くとだめになったという話を見たことがある。 すでに指摘がありますが、単に抗体を作るだけなら変性した状態でも大丈夫です。封入体をそのまま動物に打つ場合もあるようです。

(無題) 削除/引用 No.13224-2 - 2026/03/04 (水) 22:34:25 - 774R 免疫の抗原として使いたいだけならリフォールディングとか気にする必要ありますかね？ SDS-PAGEのゲルからバンドを切り出して回収すれば十分じゃないかな？

封入体可溶化後のタンパク質のリフォールディング 削除/引用 No.13224-1 - 2026/03/04 (水) 18:52:07 - ころっけ いつもお世話になっております。 大腸菌で発現させたタンパク質を精製しようと思っています。 最終的な目的は抗体作製です。 大腸菌に発現させたところ、封入体で目的のタンパク質が確認されたため、8MUreaで可溶化させたのち、精製しました。その後のリフォールディングについてこれまでリン酸バッファーにUreaを溶かした溶液で段階的に透析を行っていました。 今回はより正確にリフォールディングしたいことや凝集を防ぎたいことから外液にDTTやアルギニンの添加を検討しているのですが、皆様はどのようなバッファーで透析されていますか。 差し支えなければアドバイスいただけますと幸いです。

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