全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(質問) 2-MEの臭い、培養上清回収後の遠心操作 削除/引用 No.2310-8 - 2013/08/28 (水) 13:20:57 - LN 便乗質問失礼します。 当方も質問者さんと似たようなトラブルに困っています。 マウスを免疫後に鼠径リンパ節を回収し、リンパ節細胞を抗原で再度刺激し、上清中のIL-4、IL-17、IFNg濃度の測定をELISAで試みています。 mediumはRPMI/10%FBS/20microM 2-ME　です。 上記のサイトカインを測定したところmediumだけのwellと同じ値で検出できませんでした。 増殖assay（BrdU)では刺激による明らかな増殖は認めませんでした。 ELISAの検量線用のスタンダードはうまく反応が出ていますので、ELISAキット(R&D)自体には問題はないと思います。 ※今回、ポジコンとしてのconAなどは用意していません。 このトピックを見て、もしかして2-MEの量を調整時に間違えて高濃度加えてしまい、細胞毒性が出ているのかも、とヒヤッとしているところです。 質問です。 #1、もし最初の質問者さんの書かれているような200mMとか20mMとか通常の1000倍量を入れてしまった場合はやはり毒性が出てしまいますでしょうか。 もしそんな高濃度を試されたことがある人がいましたら教えてください。 #2、リンパ球培養に使う濃度の20-50マイクロMで2-MEを調整した場合、多少臭いますでしょうか. この培地は初めて調整したのですが、ほんのり2-MEの香りがします。もちろんウエスタンのサンプルバーファーのような強い臭いではないですが。 20-50マイクロMで2-MEを調整した場合、多少2-MEの臭いがする、ということでいいでしょうか。 #3、サンプル回収時に細胞は遠心して除いたほうがいいでしょうか。 今回培養上清をチューブに移し、そのまま-80Cに2週間ほど保存しました。 ネットの情報で、「培養上清を回収した際はチューブを遠心して細胞などを落としてから、上清を凍結するように。もし細胞が混入すると内因性のプロテアーゼでサイトカインも分解されてしまう」という記載を見ました。 細胞成分を取り除かなかったことがどの程度Criticalでしょうか。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2310-7 - 2013/08/28 (水) 06:12:15 - おお ttps://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2002-April/022078.html ttp://www.jimmunol.org/content/116/4/1071.long 50uMでやってますねぇ マイクロと書こうと思ってmになってしまったのかそれともmとおもってたのか

(無題) 削除/引用 No.2310-6 - 2013/08/27 (火) 13:57:24 - aaaaaa 2-ME等の還元剤を培地に入れるのは、活性酸素種がリンパ球を刺激して悪さをするのを抑えるためです。 割と一般的だと思います。 濃度は100microMだったと記憶しています。

(無題) 削除/引用 No.2310-5 - 2013/08/27 (火) 10:22:37 - alpha 皆さんが書かれていますが、200mMは高濃度だと思います。 私のラボでも同じような実験系で検討を行うこともありますが、そのような差が検出されたことはありません。 もう一度、培地組成の検討から始められたほうがよろしいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2310-4 - 2013/08/22 (木) 13:53:02 - おお 2MEは2-メルかぷとエタノールのことですよね。それとも何か違うものなんでしょうか。 前者ならかなり量がおおいですね。一度プロとコールを確認されたほうがよろしいかと。 1mM以下なら使うことがあるようですが、主に分化に影響するようですが。。。 すでに指摘がありますが、細胞の数をMTTなど酵素の活性として測定していたなら、それに対する影響もでてるかもしれません。 ELISAも抗体に何らかの影響が出てるかもしれませんよそのような濃度の2MEなら。 10mMぐらいならIPは大丈夫だそうですけど。

(無題) 削除/引用 No.2310-3 - 2013/08/21 (水) 22:16:55 - qq ＞キットを用いて測定した。その結果、生きているリンパ球量は2ME添加のウェルのほうが多かった。 beta-MEを添加すると、細胞が2daysでどんどん増えるということでしょうか？ それとも、細胞はどんどん死んでいるのが、beta-MEで死ななくなるのでしょうか？ MTTやWSTアッセイでしょうが、0.2M beta-MEで直接還元されて、発色する可能性はないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2310-2 - 2013/08/21 (水) 21:37:24 - TK-1 200 mM という濃度はどうやって決めたんですか？ リンパ球培養の際にはmediaに2MEを加えますが、濃度は0.05mMです。2MEを加える加えないの差というより、ただ単にtoxicityの問題じゃないの？westernのsample buffer (1x)で150mMくらいです。

メルカプト添加培地はリンパ球のリンフォカイン産生を阻害する? 削除/引用 No.2310-1 - 2013/08/21 (水) 18:46:54 - mammal いつもお世話になっております。 勉強不足ですが、ご指導のほどよろしくお願いいたします。 【目的】 とある哺乳類の脾臓由来リンパ球のIFN-γの測定系をラボ内で確立 【方法】 調製した脾臓由来リンパ球は以下の4条件で48時間培養した後、市販のキット(ELISA)を用いてIFN-γを測定。 1)200mM 2ME添加、conA刺激あり 2)200mM 2ME添加、conA刺激なし 3)200mM 2ME無添加、conA刺激あり 4)200mM 2ME無添加、conA刺激なし 【結果】 conA無刺激ではサイトカインは全く検出されなかったのに対し、 conA刺激ウェルは2MEの存在にかかわらずサイトカインを検出した。 しかし、2ME添加ウェルでは無添加と比べ、1/18量のサイトカイン しか検出されなかった。 【問題点】 サイトカイン測定と同時に、48時間培養後の生きたリンパ球数もキットを用いて測定した。 その結果、生きているリンパ球量は2ME添加のウェルのほうが多かった。 【質問】 1)リンパ球培養時に2MEを入れるというのは一般的ですか?また、動物種によって異なりますか? 2)2MEによるサイトカイン産生阻害というのは一般的に起こるものですか?また、その原因はなんでしょうか? 3)当研究で今後行いたいことは、ワクチン抗原接種後に個体より脾臓を摘出し、リンパ球をワクチン抗原で再刺激してやることによって、細胞性免疫の上りを確認することです。それにあたって、私の確認している刺激後リンパ球増殖とサイトカイン測定というのは正しい選択ですか? 今回初めて細胞性免疫にかかわる仕事をすることになり、わからないことだらけで困っています。 何卒、よろしくお願い申し上げます。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---