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(無題) 削除/引用 No.2329-20 - 2013/12/10 (火) 20:27:41 - ななし 解決しましたか？ そもそもテトラスパニンファミリーのタンパク質にDTTなどの還元剤は入れてはいけません。

(無題) 削除/引用 No.2329-19 - 2013/10/17 (木) 22:40:28 - 名無し 今度、その沈殿ポイしないで、SDS-sample bufferに溶かして、少し超音波かけてDNA切って（もしちょーおんぱ持ってなければシリンジで出し入れすると切れる）それをウェスタンする。加熱あり／なしの両方試すといい。SDSありだと確かにブラッドフォールドは駄目だが、BCAとかそっち系でならいける。ていうかあるかないか見るだけだし、BCAわざわざ買うまでもなく、蛋白質濃度測定パスして適当に3~10μl／wellとかで何点か振ってみるのでもいい。それ見てもしなんか沈殿にありそうな感じならあらためてちゃんとデータとればいい。

(無題) 削除/引用 No.2329-18 - 2013/10/17 (木) 14:33:29 - さ ポジコンがないときりがない話になりかねないので、トランスフェクションでバンドが出るか試しすのがいいのではないですか？ クローンを手に入れるのがひと手間でしょうから、どのくらいどのくらい大事な実験かによりますが。

(無題) 削除/引用 No.2329-17 - 2013/10/16 (水) 20:52:02 - flow joe 解決しましたか？ CD9はSDSのボイルで凝集したことはないですね。 SDSではなく別の界面活性剤で可溶化しましたか？ 還元剤の有無は？ 濃度的に1/400希釈であればノンスペも無く十分検出できそうな濃度の抗体ですね。 少し前ではCD9抗体は良いのを選ぶ必要があると聞いたことがありますが、データシートを見る限り良さそうな抗体ですけどね。 最近は二次抗体はgoatが多いですよね。rabbitの二次抗体は使った事が無いなあ。

(無題) 削除/引用 No.2329-16 - 2013/08/30 (金) 09:11:34 - こうぼ >>名無し様 NP40で溶かした後遠心して不溶物除いてからSDSでボイルしています。NP-40で可溶化したのはbradford法でタンパク量を定量したかったためです。確かに不溶物の中に目的のタンパクが残っていた可能性はありますね。 >>ｖｖｖ様 抗体反応液やブロッキング剤を変えて検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.2329-15 - 2013/08/30 (金) 08:02:48 - ｖｖｖ あまりウェスタンを行わないので素人発言ですが、抗体をPBSTで希釈していますよね？ 何かの抗体はPBSTで希釈すると発現に影響が出るから、基本的にはTBSTで希釈するように指示されたような気がします。 我々のところでは、2%スキムミルク in TBSTで抗体希釈には用いています。 素人発言で申し訳ありません。 戯言ですので聞き流してください。

(無題) 削除/引用 No.2329-14 - 2013/08/29 (木) 20:14:28 - 名無し NP40で溶かした後遠心して不溶物除いてから、ということかな、それともNP40で溶かして続けてSDSとうことな、どっち？。もし前者ならその不溶物が気になる。後者ならはじめにNP40で溶かす意味はない気がする、直接SDS bufferでよくね。 NP40とSDSは相性悪いとおもうんだが。うちらはよく2%SDSで可溶化したものからIPするとき,１％NP40入りの当たり障りのないバッファーで20倍くらいまで希釈する、これはSDSの濃度を下げるのと同時にNP40でSDSの作用を減弱させるんだとか昔習った。

(無題) 削除/引用 No.2329-13 - 2013/08/29 (木) 09:58:09 - おお 逆の意見もあるということで、わたしならNP-40だけで溶解するとか、膜蛋白ということなのでTX-114などを用いて膜蛋白だけ回収するとかすることを考えると思います。 余分なものを乗せない方が検出かんどやバンドの出方がよかったりしますので。

研究費も大切に使いましょう 削除/引用 No.2329-12 - 2013/08/29 (木) 09:52:14 - flow joe >1% NP-40でボルテックした後にDTT入りのSDSでボイルしています IPするわけでもないのにNP-40をかませる意味がないのでPBS中で集めて直にSDS sample bufferに可溶化してみると良いと思います。非還元の状態でも試してみると良いかもしれません。 確実に十分量の抗原が存在すると断言できるのであれば、業者での抗体の保存が悪くて失活しているかもしれません。データを示して交換してもらって大丈夫だったことがあります。それでもダメなら別商品と交換してもらうと良いかもしれません。 ハズレの抗体を引いたからといって泣き寝入りする必要はありません。返品してもらいましょう。

(無題) 削除/引用 No.2329-11 - 2013/08/29 (木) 09:18:11 - こうぼ >おお様 そうですね。高いお金を支払っていますし、アブカムに相談することにします。 >ぽじ様 本当はメーカーが販売しているライセートが欲しかったのですが、赤貧なので自分で調整したという次第です。 >名無し様 抽出条件は、かき集めた細胞を1% NP-40でボルテックした後にDTT入りのSDSでボイルしています。まず間違いな可溶化できていると思うんですけどね。

(無題) 削除/引用 No.2329-10 - 2013/08/29 (木) 07:04:19 - 名無し 抽出条件はどんなかんじよ。それが重要な情報だな。膜蛋白質ということも考えるともしかしたらこれらの蛋白質の可溶化に適さない可能性があるから。SDS-sample buffer（これなら大抵のもは溶かせるはず）で直接lysisしたものでみてみた？ PS, こうぼ　さんへ N02329-6の下から２行目後半の表記はちゃんと撤回した方がいいと思う。こういう非常に重い言葉は、確実な証拠もなくこういった場所で軽々に使うような言葉じゃないと私はおもう。

(無題) 削除/引用 No.2329-9 - 2013/08/28 (水) 11:16:04 - ぽじ lysis bufferの組成が違うと上手く抽出できないこともあるかもしれないですが、メーカーがポジティブコントロールとして売ってるcell lysateでも出ないか確認してみては？ 少なくともサンタは売ってるので、それで出ないのであれば抗体が悪いか、細胞がおかしくなってるか。

(無題) 削除/引用 No.2329-8 - 2013/08/28 (水) 10:12:38 - おお abcamは一応サポートの対応でのQAも乗せていたりしてある程度誠意を感じるので質問してみてもいいかもよ。 知り合いはその蛋白ではないのですがニトロセルロースでは検出できなくってその抗体を売っている会社にといあわせたら、カタログの図はPVDFでやっていると聞き出し、PVDFでやったらうまくいったというはなしをしてました。

(無題) 削除/引用 No.2329-7 - 2013/08/28 (水) 09:55:47 - おお >[Re:4] こうぼさんは書きました : > >>おお様 > > 目的のタンパクの抗体がマウス以外のポリクロだと問題が生じやすいのですか？2次抗体はウサギのモノクロを使っています。 いやいや、ちゃんと2次抗体が働いているか結論が出ないでしょうということです。とくにどちらだと問題が出やすいという話ではなくて

(無題) 削除/引用 No.2329-6 - 2013/08/28 (水) 09:52:00 - こうぼ >flow joe様 Santa cruzはsc-13118, sc-5275、アブカムはab134045です。 ttp://www.scbt.jp/datasheet-13118-cd9-c-4-antibody.html ttp://www.scbt.jp/datasheet-5275-cd63-mx-49-129-5-antibody.html ttp://www.abcam.co.jp/cd63-antibody-epr5702-ab134045.html データシートではライセートのウエスタンの写真が載っているのですが、捏造ではないかと疑いました。

(無題) 削除/引用 No.2329-5 - 2013/08/28 (水) 09:25:56 - flow joe 抗体のカタログ番号などを示すと何かヒントが得られるかも。

(無題) 削除/引用 No.2329-4 - 2013/08/28 (水) 09:17:20 - こうぼ >>おお様 目的のタンパクの抗体がマウス以外のポリクロだと問題が生じやすいのですか？2次抗体はウサギのモノクロを使っています。

(無題) 削除/引用 No.2329-3 - 2013/08/28 (水) 06:40:37 - おお >[Re:1] こうぼさんは書きました : > お世話になります。 > > サイズはCD9が24kDa、CD63が30-65kDaなので、極端に大きいとか小さいということはありません。サイズの似たハイスキーピングの抗体では正常な結果が得られますので、サンプルの問題やブロッティングのミスというわけはなさそうです。 ハウスキーピングでうまく行くからといって万全とはいいにくいですね。。。ハウスキーピングでインターナルコントロールにつかわれるものは量が多くて、非常にシグナルがつよいです。 > > CD9, CD63は膜タンパクであるため、SDSでボイルした際に凝集してしまったからかなと考えているのですが、 それならスタッキングゲルとの境界からスメアーなバンドが見られることがあります。あるいはダイマーとかとるタンパクだと2倍ぐらいのサイズにでてくるとか。ほんとに凝縮しているのなら、遠心して沈殿を6Mぐらいの尿素でけんだくしてから流すとバンドがみえそうだけど、ボイルで凝縮したかも分からないので無駄かもしれません。 >他に考えられる原因があれば教えて頂けませんか？ ハウスキーピングがモノクロ(マウス)で目的のタンパクの抗体がポリクロ(マウス以外)ならポリクロのほうの2次抗体を疑ってもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2329-2 - 2013/08/27 (火) 21:13:21 - TK-1 FACSで見れないんですか。ウェスタンより定量性があります。

CD9とCD63のウエスタンブロッティングについて 削除/引用 No.2329-1 - 2013/08/27 (火) 16:34:11 - こうぼ お世話になります。 Helaライセートに対してSanta CruzとアブカムのCD9, CD63抗体を使ってウエスタンブロッティングをしているのですが、バンドが検出できません。 論文やメーカーの推奨条件を参考にしてHela ライセート量はタンパク質総量で20ug、ブロッキング剤は5%スキムミルクで、１次・2次抗体反応液はPBSTを使用しています。 サイズはCD9が24kDa、CD63が30-65kDaなので、極端に大きいとか小さいということはありません。サイズの似たハイスキーピングの抗体では正常な結果が得られますので、サンプルの問題やブロッティングのミスというわけはなさそうです。 CD9, CD63は膜タンパクであるため、SDSでボイルした際に凝集してしまったからかなと考えているのですが、他に考えられる原因があれば教えて頂けませんか？ 宜しくお願いします。

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