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(無題) 削除/引用 No.2332-8 - 2013/08/29 (木) 23:56:17 - dd ＞〜様 重ねて返信していただきありがとうございます。 ＞コロニーカウントがうまくいかない条件が手技の問題であれば、PCRでもうまくいかない可能性は高いのではないかと思います。 確かにその通りだと思います。コロニーカウントでうまくできなかったのは段階希釈の読みが甘く、どれかはカウントできないくらい多いか０でした。もう一度コロニーカウントを慎重にやってみようと思います。 ＞波平様 回答有難うございます。 ＞これは生菌のみを調べることできるので，DNAによる解析とは異なってきます．DNAによる解析では死菌も含まれてくるので，データーの意味が異なってきます。 恥ずかしながらこの点について全く考えていませんでした。菌が死ぬまで長時間培養するつもりはありませんでしたが、もう一度考えなおしてみたいと思います。 ＞それぞれの細胞の大きさもしくは形が違い、 この点については、双方とも似ている菌体のため、見分けることは困難かと思います。 ご助言ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2332-7 - 2013/08/29 (木) 22:56:40 - 波平 私もコロニーカウントが一番簡単だと思います．できるなら． しかし，これは生菌のみを調べることできるので，DNAによる解析とは異なってきます． DNAによる解析では死菌も含まれてくるので，データーの意味が異なってきます． どちらを解析したいのかきちんとした方がよいと思います． もし，それぞれの細胞の大きさもしくは形が違い，油浸で対物100倍くらいの顕微鏡があって，写真撮影できるなら，ヘマトメーターを用いた顕微鏡観察でも解析できます． ちなみにこれは死菌を含めた全細胞の解析になります．

(無題) 削除/引用 No.2332-6 - 2013/08/29 (木) 15:55:34 - ~ >最初はコロニーカウントをして比較しようと考えたのですが、誤差が大きくリアルタイムPCRでと考えたところでした。 コロニーカウントの誤差の原因は、操作の熟練等では対応できないものなのでしょうか？ 片方の菌のみを選択できる培養条件が無い等の理由があるのでしょうか？ コロニーカウントで誤差（大きなばらつき）が生じているというのであれば、基本的にはサンプリングと希釈、塗布部分あたりが原因になると思います。 PCRの場合は、このうちの希釈と塗布はなくなりますが、DNAの抽出効率や回収率、PCRの試薬をきちんと各チューブに均一に入れられるかあたりに新たな誤差が起きうるようになります。 それらは、コロニーカウントでいうところの希釈と同程度の難易度の操作ではないかと思います。 そのため、コロニーカウントがうまくいかない条件が手技の問題であれば、 PCRでもうまくいかない可能性は高いのではないかと思います。 今回の実験ではサンプルの性質上コロニーカウントがうまくいかないものであったり、PCRの手技の習得等が目的に入っていればいいのかもしれませんが、 そうでなければコロニーカウントの手技の確認をされた方が安上がりで効率がいいと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2332-5 - 2013/08/29 (木) 13:10:20 - dd ＞おお様 そうですよね。申し訳ありません。どういったデータが欲しいのか再確認したいと思います。 ＞mon様 今のところ２種で行おうと考えており、プライマーはそれぞれ別に用意してあります。というか、前の先生が残していったプライマーですが。 マルチプレックスPCR、調べてみます。情報有難うございます。 ＞〜様 ＞Ct値等で比較するのであれば、検量線を引くことなく比較ができる場合があります。 ＞検量線が必要な状況であれば、プライマーセットごとに検量線が必要になるかと思います。 controlの単独培養と共培養の菌数との増減の比較、また菌体をプロテアーゼ阻害剤で処理したものとの共培養の比較をしようと考えています。 最初はコロニーカウントをして比較しようと考えたのですが、誤差が大きくリアルタイムPCRでと考えたところでした。私もよくわかっていないのに丁寧にお答えいただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2332-4 - 2013/08/29 (木) 11:30:28 - ~ >複数菌共培養して単独培養と比較する場合、検量線は必要でしょうか？ 行う実験手法と評価法次第です。 半定量PCRとして、バンドの濃さでサンプル間の比較をするのであれば、検量線は使われませんね。 Ct値等で比較するのであれば、検量線を引くことなく比較ができる場合があります。 どのような方法で、何を比較するのかを確認しましょう。 >データとしてそれぞれのコピー数が必要なのか、相対的に比較すればいいのか、正直判断がつきません。 データとして何が必要なのかは、目的次第です。 目的を確認しましょう。 >それぞれの菌に対して検量線が必要なのか、DNAのコピー数の基準が分かればいいのなら１つあればいいのかとも思います。 実験次第ですが、それぞれの菌についてという表現をされていますので、特定の菌でのみDNAが増幅されるプライマーセットを使用されるのではないのでしょうか？ そうであれば、検量線が必要な状況であれば、プライマーセットごとに検量線が必要になるかと思います。 DNAのコピー数の基準というのが、複数の条件に同時に適用できるものであり、それを使ってサンプル間の比較をできるものであれば、そのコピー数の基準を使って比較することができることになります。 そのため、何をやって、何が分かり、それで目的が達成できるのかを確認しましょう。

(無題) 削除/引用 No.2332-3 - 2013/08/29 (木) 07:57:03 - mon 同じprimerで異なる鋳型を増やすのか、それぞれ異なるprimer（異なる鋳型）なのかで、検討事項が異なります。 例えば、少なくともそれぞれのPCR（primer、鋳型およびその濃度）がお互い他のPCRに影響しないことを検証されていないと厄介です。 "multiplex PCR"で文献検索したらいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2332-2 - 2013/08/28 (水) 23:29:31 - おお わからなさ過ぎだとおもいます。まずはあなたの実験の目的など整理してみてください。

複数菌共培養した時のPCR 削除/引用 No.2332-1 - 2013/08/28 (水) 20:59:55 - dd いつもお世話になっております。 今回質問させていただきたいのは、複数菌共培養した時のPCRについてです。 身近に詳しい方がいないため、基本的なことを伺うと思いますがよろしくお願い致します。 まず、複数菌共培養して単独培養と比較する場合、検量線は必要でしょうか？データとしてそれぞれのコピー数が必要なのか、相対的に比較すればいいのか、正直判断がつきません。 また、それぞれの菌に対して検量線が必要なのか、DNAのコピー数の基準が分かればいいのなら１つあればいいのかとも思います。 初心者のため、わからなさ過ぎかもしれませんが、よろしくお願い致します。

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