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(無題) 削除/引用 No.2333-8 - 2013/09/03 (火) 10:12:02 - AP オフターゲットは起こらないだろうと予測ができたところで、本当に起こっていないかということは保証されませんよね。極端な話、stable lineを作製するときのように、入れたコンストラクトがランダムな組込みを起こして、挿入点の遺伝子を破壊しているかもしれない。また、仕掛けたからくりとは無関係に起こった自然突然変異を持っている細胞が混じっているかもしれませんよね。 やっぱり複数の独立したクローンをとるべきで、共通して見られる現象はターゲティングに因るものだろう、例外的な現象はなにか別の要因によるのだろう、と考えるものではないですか。

(無題) 削除/引用 No.2333-7 - 2013/09/01 (日) 19:10:39 - りん >[Re:6] APさんは書きました : > 切れていてもオフターゲットの切断も持っている細胞が混在していてヘテロな集団になっている可能性もあるし、 オフターゲット効果があるかは事前に予測できるかとは思いますが、プラスミドを導入して標的遺伝子のKO細胞（と思われるもの）を拾ってきた後で、それらの細胞内に実はオフターゲット効果が出ていた、なんてことはみなさんどのように調べられていますか？

(無題) 削除/引用 No.2333-6 - 2013/08/31 (土) 10:56:26 - AP 実際はKO細胞を薬剤耐性で選択しても、相同組換えによらずランダムな組込みを起こしたものもかなり生じるという点でもクローニングは必要ですね。 標的配列に二重鎖切断を起こす系でも、コンストラクトは持っているけれど切れていないというのもあるだろうし、切れていてもオフターゲットの切断も持っている細胞が混在していてヘテロな集団になっている可能性もあるし、クローニングしないと何を見ているのかわからないじゃないかと言われるんじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.2333-5 - 2013/08/31 (土) 10:29:15 - おお >[Re:1] りんさんは書きました : > いつも勉強させていただいています。 > > TALENのように標的配列＋薬剤耐性マーカーののったプラスミドを細胞にいれたのちに、例えばピューロマイシンなどでセレクションして、残った細胞を採ってきたとしても、ゲノムの切断効率が100％でない限り、そのなかには、ゲノム上の標的配列がちゃんと切断されなかった細胞（野生型と同じ）も当然混ざってくるわけですよね。この場合のプラスミドは一過性発現のために入れているわけですから、いつまでもピューロマイシンを培地に入れておくわけにもいかず、どこかのタイミングで通常の培地に戻さないといけなくなるわけですよね。通常の培地でずっとパッセージを繰り返しておくと、ゲノムがちゃんと切断されなかった野生型細胞がどんどん増えてしまっていつかは、ゲノム切断がうまくいった細胞の方がマイナーになってしまうときがくるような気がするのですが、みなさんはどう思われますか？ そうですね。なので私もクローニング以外に思いつきません。 そもそもホモろがすりコンビネーションでKOとかするばあいも、薬剤マーカーでセレクションできるように設計されたりしてますが、それでもクローにんぐしないとうまくはいっていないクローンもまじっているので使い物になりませんよね。

(無題) 削除/引用 No.2333-4 - 2013/08/31 (土) 09:48:09 - Harmonia なるほど困難な課題です。 ノックアウトの場合、標的遺伝子の代わりに薬剤耐性遺伝子が入っていれば、 遺伝子が破壊されたものは薬剤耐性になっている、ということが成り立ちま す。しかし、TALENの場合、欲しい細胞は標的遺伝子に傷が入っている、と いう条件が与えられているのみで、一過性発現のためのプラスミドは、むし ろ持っていてほしくない。 クローニング以外に思いつきません。

(無題) 削除/引用 No.2333-3 - 2013/08/30 (金) 20:34:24 - モモ 私ならクローンを取りますが、バルクでやりたいなら維持するほうはずっとピューロを入れといて、実験に使う分をその都度ピューロを抜いてやればなんとかなりませんかね。

(無題) 削除/引用 No.2333-2 - 2013/08/29 (木) 14:59:42 - AP 細胞のクローニングをするんじゃない？ >例えばピューロマイシンなどでセレクションして、残った細胞を採ってきたとしても、ゲノムの切断効率が100％でない限り、そのなかには、ゲノム上の標的配列がちゃんと切断されなかった細胞（野生型と同じ）も当然混ざってくるわけですよね。 これをノックアウトマウスを遺伝子ターゲティングによって作製しようというときの、ES細胞のノックアウトに置き換えて考えてみたら、

ゲノムを切断された細胞について 削除/引用 No.2333-1 - 2013/08/29 (木) 13:41:53 - りん いつも勉強させていただいています。 TALENのように標的配列＋薬剤耐性マーカーののったプラスミドを細胞にいれたのちに、例えばピューロマイシンなどでセレクションして、残った細胞を採ってきたとしても、ゲノムの切断効率が100％でない限り、そのなかには、ゲノム上の標的配列がちゃんと切断されなかった細胞（野生型と同じ）も当然混ざってくるわけですよね。この場合のプラスミドは一過性発現のために入れているわけですから、いつまでもピューロマイシンを培地に入れておくわけにもいかず、どこかのタイミングで通常の培地に戻さないといけなくなるわけですよね。通常の培地でずっとパッセージを繰り返しておくと、ゲノムがちゃんと切断されなかった野生型細胞がどんどん増えてしまっていつかは、ゲノム切断がうまくいった細胞の方がマイナーになってしまうときがくるような気がするのですが、みなさんはどう思われますか？ 長文申し訳ございません。

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