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(無題) 削除/引用 No.2339-20 - 2013/09/04 (水) 09:12:14 - コロニー 皆様 この度は、貴重なアドバイス、誠にありがとうございます。 大変勉強になりました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2339-19 - 2013/09/04 (水) 01:58:47 - おお >はい、ありがとうございます。 >ある遺伝子を欠失させた菌体を作ったものの、欠失させた菌体にWTの菌体のコ >ンタミが考えられ、従来のPCRでは感度が高くなく、 検出感度の気にしているなら、従来のPCRのほうがいいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2339-18 - 2013/09/03 (火) 14:39:12 - AA すでに確立している欠損株で正しい結果が得られない状態なのか、 自分で新たに作成した欠損株でほしい結果が得られないのか、 すでに試されたというコロニーPCRにおいて、どちらの状態なのかで対応が変わるのではないかと思います。 確立済みの株で正しい結果が得られないのなら、どこかでいれ違って異なる株と勘違いしているか、はたまたどこかでその遺伝子を含む外来DNAを形質転換してしまったか、どちらにせよ全部捨てて大元から増やし直すべきでしょう。 ご自分で新たに作成されたのであれば、欠損自体がうまくできてない可能性を考慮スべきだと思います。すでにご指摘のあるようにコロニーPCRはシングルコロニーを拾って来て確認するため、シングルクローンであると考えるべきだからです。 (シングルでつっつけないほど密に生やしているなら問題外ですが) どちらにせよ、なぜコロニーPCR出ないといけないのでしょうか？ 欠損を確認したいのなら、MiniPrepなりで精製して普通にPCRすべきでは？ コロニーPCRはクローン数が多い時に時間や手間の短縮のために簡易でやるものであって、正確さが必要なら避けるべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.2339-17 - 2013/09/03 (火) 13:59:45 - おお みなさんが仰るようにリアルタイムPCRである必要はまったくないですよ。かえって条件に気を使わないとPCRして電気えいどうで流すより訳が分からなくなります。 さらにすでに指摘がありますが、コロニーをひろったら基本的にWTとMTが混在するはずがないですよね(余程特別なことが起こってない限り)。 PCRが何かスッキリしないなら、サザンブロットにした方がいいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2339-16 - 2013/09/03 (火) 13:44:00 - mon >ある遺伝子を欠失させた菌体を作ったものの、欠失させた菌体にWTの菌体のコンタミが考えられ もしかして、いわゆるPCR産物のPCR反応系へのコンタミが生じ、本来negativeになるはずが一見positiveになっているのかな。 鋳型なしPCRで、無バンドになりますか？（要はnegative controlがきちんとworkしているか否か？）

(無題) 削除/引用 No.2339-15 - 2013/09/03 (火) 13:35:33 - AP >なぜ、まず欠失体をクローンとして分離しないのか？ いや、まてまて。シングルコロニーを拾っているにだから、そもそもその細胞集団はクローンのはずだよな。 想像だけれども、欠失体を取ったけれど期待していた現象が起こらなかったかして、どうしても野生型がコンタミしていることにしたいとか？

(無題) 削除/引用 No.2339-14 - 2013/09/03 (火) 13:24:05 - ~ 「遺伝子欠損株（ただし、野生株が何ppm含まれている）を用いて実験を行った」のような報告をする予定なのでしょうか。 検出系の選択についての前に、実験系の作り方に疑問がありますが。 >ある遺伝子を欠失させた菌体を作ったものの、欠失させた菌体にWTの菌体のコンタミが考えられ、 よほど特殊な菌を使っていて、単離することができないという事情がないのであれば、そのまま使うという考え方は受け入れられないと思いますが。 普通に考えると、プレートに撒きなおしてシングルコロニーを拾いなおせばいい話ですよね？ その遺伝子欠損株を使って今後の実験をするのですよね。 混ざった状態で実験する必要はないでしょう。 >コピー数の影響は受けないと考え、1コピーしかない遺伝子であれば、ありなしに近い形で結果が出ることが期待しています。 >従来のPCRでは感度が高くなく、またバンドの有無でしか判定できないため、 ありなしの結果を期待しているが、より感度を高めるためにリアルタイムPCRで評価したいということですね。 想定されている従来のPCRとリアルタイムPCRの検出下限のCFU数は、それぞれいくつなのでしょうか？ シングルコロニーを取得すれば、その検出下限の違いは影響しないのではありませんか？

(無題) 削除/引用 No.2339-13 - 2013/09/03 (火) 13:09:57 - AP >ある遺伝子を欠失させた菌体を作ったものの、欠失させた菌体にWTの菌体のコンタミが考えられ、従来のPCRでは感度が高くなく、またバンドの有無でしか判定できないため、リアルタイムPCRを行うことを考えております。 あなたの説明からはそういう実験意図がまったくわかりませんでしたし、あまり一般性のある実験デザインではないと思います。 これだけ説明されてもまだ実験の意図がよくわからないところがあります。 ・なぜ「欠失させた菌体にWTの菌体のコンタミが考えられ」るのか。なぜ、まず欠失体をクローンとして分離しないのか？ ・従来のPCRでは感度が低いと言うが、それがreal-time PCRで解決するのか？qPCRである必要があるのか？　そもそもどれだけ微量な「コンタミ」までを問題にするのか。それだけ微量であったときPCR操作上の「コンタミ」と区別をつける手立てはあるのか。それだけ微妙な実験をやるのにコロニーPCRみたいな手抜きをまず考えるというのは、バランスを欠いているのではないか。 ・もし、本当にwtがコンタミしているということがわかったとして、実験上の問題がなにか解決するのか？

(無題) 削除/引用 No.2339-11 - 2013/09/03 (火) 12:14:07 - コロニー ~さま 御教授ありがとうございます。 ゲノム中に、１コピーある、遺伝子Aを完全欠失させております。 そのため、コピー数の影響は受けないと考え、1コピーしかない遺伝子であれば、ありなしに近い形で結果が出ることが期待しています。 ゆえに、コロニーを鋳型として、リアルタイムPCRにて伝子Aの発現を確認しようと考えております。 APさま 御教授ありがとうございます。 ＞「欠損をさせており」とは、どういう事ですか？ 欠失ですか、その他のmutationですか？ 構造既知の欠失です。 ＞構造既知の欠失であれば、欠失領域のPCRはかからないけれどbeakpointを挟んだプライマーだと欠失と矛盾しないサイズのPCR産物を生じるということで証明できるでしょう。 しかし、realtime PCR産物の有無を調べるだけなら、realtime PCRでも出来ることはできるけれど、そうする理由がないですよね。realtime PCRでなにをみようというのですか？ はい、ありがとうございます。 ある遺伝子を欠失させた菌体を作ったものの、欠失させた菌体にWTの菌体のコンタミが考えられ、従来のPCRでは感度が高くなく、またバンドの有無でしか判定できないため、リアルタイムPCRを行うことを考えております。 そういう理由で、コロニーを使用してリアルタイムPCRを行うことを考えました。。。

(無題) 削除/引用 No.2339-10 - 2013/09/03 (火) 11:30:57 - AP >その欠損を確認したいと思っております。 それはどう曲解しても「発現の有無」ではないでしょう。用語は正確な定義にしたがって使われないと、意図が伝わりませんよ。 DNAを鋳型にPCRをかけるというなら、コロニーPCR的な方法でもできるでしょう。 「欠損をさせており」とは、どういう事ですか？ 欠失ですか、その他のmutationですか？ 欠損後の構造は分かっているのですか？　未知ですか？ 構造既知の欠失であれば、欠失領域のPCRはかからないけれどbeakpointを挟んだプライマーだと欠失と矛盾しないサイズのPCR産物を生じるということで証明できるでしょう。 しかし、realtime PCR産物の有無を調べるだけなら、realtime PCRでも出来ることはできるけれど、そうする理由がないですよね。realtime PCRでなにをみようというのですか？

(無題) 削除/引用 No.2339-9 - 2013/09/03 (火) 11:00:44 - おお >[Re:5] コロニーさんは書きました : > ゲノム上である遺伝子の発現を欠損させており、 ? > その欠損を確認したいと思っております。 欠損ということは、有無をみるわけですよね。通常のPCRがよくないかもと思う理由はなんでしょうか? ある配列があるかどうかを見るなら通常のPCRで何の遜色もないですけど、、、あえてqPCRをしたいというなら、 コロニーよりも液体バイチでODを図りinput量のばらつきを抑えたうえで、インターナルコントロールを取ったうえで、コントロールとの比較であるかないかを判断すればいいかと思いますが。 ただほかにやっている文献とかないなら、どの程度再現性ある実験になるのかとかいろいろと検証も加えながら実験しないといけないかと思いますが、、、

(無題) 削除/引用 No.2339-8 - 2013/09/03 (火) 10:50:49 - R >ある遺伝子の発現の有無をきちんと調べたいと思い >ゲノム上である遺伝子の発現を欠損させており、 >その欠損を確認したいと思っております。 何を調べたいのでしょうか？ 発現を定量？ 欠損を定性？ ゲノム上のコピー数の定量？ >従来のコロニーPCRではいまいちかなと コロニーPCRのvalidation? コロニーPCRの代替をお探し?

(無題) 削除/引用 No.2339-7 - 2013/09/03 (火) 10:16:25 - ~ あれ？ もしかして、菌体内のコピー数の分かっている遺伝子も増幅させて、持ち込まれたゲノムDNAのコピー数の補正をかける予定なのでしょうか？ そうであれば実験として成立するとは思いますが、その手間をかける意味があるか疑問です。

(無題) 削除/引用 No.2339-6 - 2013/09/03 (火) 10:12:31 - ~ ゲノミックPCRで、特定の配列の増幅効率を見たいということですね。 まずはじめに、菌体を直接持ち込んでリアルタイムPCRで定量するということは、持ち込まれるテンプレートのコピー数は、楊枝についた菌体のうちのチューブに入った菌体中のコピー数になりますよね。 持ち込まれた菌体量が半分になれば、コピー数も半分になりますが、その定量結果をどのように使われるのでしょうか？ 1コピーしかない遺伝子であれば、ありなしに近い形で結果が出ることが期待されますし、 複数コピーある遺伝子のうちの1コピーを潰しているのであれば、菌体の持ち込み量の影響を受ける条件では、コピー数の推定ができないでしょう。 従来のコロニーPCRがいまいちと考える理由と、定量PCRで定量された結果がどうだったらあたりのクローンが得られていると解釈する予定なのかを、明文化してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2339-5 - 2013/09/03 (火) 10:03:58 - コロニー APさま 御教授くださり、誠にありがとうございます。 ゲノム上である遺伝子の発現を欠損させており、 その欠損を確認したいと思っております。 そのため、cDNAである必要はないと考えております。

(無題) 削除/引用 No.2339-4 - 2013/09/03 (火) 10:00:45 - AP 発現を調べたいということはmRNAを定量したいということじゃないんですか？ だったら、RNA精製、逆転写の過程がありますよね。コロニーPCRでできると思いますか？ また、そのRNAをコードしているゲノム/プラスミドのDNAもPCRの鋳型になりますし、細菌の場合イントロンがないのでPCR産物がDNA由来かRNA由来かの区別もできません。DNAの排除を厳しく行う過程が必要ですが。

(無題) 削除/引用 No.2339-3 - 2013/09/03 (火) 09:46:47 - コロニー AAさま アドバイスくださり、ありがとうございます。 従来のコロニーPCRのように突っついたコロニーを直接PCRmixの中に入れてリアルタイムPCRするということです。 できそうですが、上手くいくのでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.2339-2 - 2013/09/03 (火) 09:32:40 - AA コロニーPCRのように突っついたコロニーを直接PCRmixの中に入れてPCRするということですか？ 僕が無知なのかもしれませんが、最近ではコロニーを突っついて RNA精製、cDNA合成、qPCRをいっぺんにできるようになったのでしょうか？

コロニーを使ってQPCR 削除/引用 No.2339-1 - 2013/09/03 (火) 09:20:46 - コロニー お世話になっております。 細菌のコロニー（細菌集落）を使用して、リアルタイムPCRはできるでしょうか。 ある遺伝子の発現の有無をきちんと調べたいと思い、従来のコロニーPCRではいまいちかなと考えております。 従来のPCRの方が良いのでしょうか。。 御教授いただけましたら、幸いです。 よろしくお願い致します。

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