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(無題) 削除/引用 No.2452-14 - 2013/10/16 (水) 07:21:00 - RN汗 たくさんの御助言と御意見を誠にありがとうございました。 参考にしまして、今後の対策にいかします。

(無題) 削除/引用 No.2452-13 - 2013/10/15 (火) 17:55:20 - AP >RNaseフリー水で溶解しています。これにRNase inhibitorを添加した方が良いでしょうか？ 精製したRNAはRNase-freeになっているはずなので（RNase-freeなっていないような精製は論外）、RNase inhibitorを入れる意味がありません。精製後のRNAにRNaseがコンタミしたときの用心としても、そもそもRNaseをコンタミしてしまうような取り扱いをするのは論外です。 RNase inhibitorを反応系に入れるのは、使用する酵素由来の（つまり生物から精製したタンパク質で、その他のタンパク質のコンタミの可能性が否定出来ない試薬）RNaseのコンタミに対する用心だと思います。また、入れる分量から言っても、そのくらいの効果しか期待できないと思います。 昔と違って、いまでは酵素の品質、純度がよくなっていますからRNase inhibitorは入れなくても大丈夫だと思って、日々実験しています。

(無題) 削除/引用 No.2452-12 - 2013/10/15 (火) 10:44:38 - seven 皆さんが言われてますが今一番やるべきことはRNAのクオリティチェックだと思います。 RNA抽出直後およびDNase処理後のRNAを比較すればどこに問題がわかると思います。

(無題) 削除/引用 No.2452-11 - 2013/10/14 (月) 22:11:28 - おお >[Re:8] RN汗さんは書きました : > もうひとつ皆様の御意見を教えてください。当方では、タカラバイオのRNAiso Plus（TRizolとほぼ同じ？））で抽出し、乾燥させたRNAを、RNaseフリー水で溶解しています。これにRNase inhibitorを添加した方が良いでしょうか？　 わたしはその段階でRNase Inhibitorを入れたことはありません。入れるとRNA量とかはかりにくいのでは? RTのときにもRNaseInhibitorを入れないで反応させてしまいます。 RNaseがもし入っているとすると、細胞からの持ち込みなども疑われます。そう言うものは試薬でつかうRNase inhibitorではブロックできないものがあります。

(無題) 削除/引用 No.2452-10 - 2013/10/14 (月) 22:00:25 - おお わたしも、plasmid精製をはじめたのがRNAを使った実験がうまくいかなかった原因かどうかちょっと疑っています。勿論できるだけ、できる範囲で用心した方がいいですが。 器具などはじっさいほとんど共通のものをつかっています。ピペットも自分専用のものがありますので自分で管理できますし、DNAワークと共用です。わたしはこまめにH2O2を使ってRNaseを失活させた環境を心がけてますが、やはりRNAを扱うのはチューブ内ですし、実験台とかアイスポックスとかアルミブロックとかラフにやっていても、ちゃんと出来るとはおもいます。そもそも氷とかRNase freeというわけにはいきませんよね。前回はかなり厳密にやっているような印象を与えるような書き方をしましたが、実際そうでもないというのが現実です。 このさいだから、RNAのクオリティーをチェックするようにしてみてはどうでしょうか。 あ、遠心きのローターはわたしも気をつかいます。RNaseはプラスみど精製いがいでもいろいろ使ったりすることがありますし、かといってチューブからこぼれていることはまずないでしょうけど、ほこりとかも気持ち悪いですし。チューブが密閉されていれば入ることはないんですけどね。

(無題) 削除/引用 No.2452-9 - 2013/10/14 (月) 17:11:20 - AP 本当にRNaseが原因でRT-PCRがうまく行っていないのか疑問です。 電気泳動やバイオアナライザーなどでRNAの品質を確認しているのでしょうか。 ざっとみたところ、RNaseを使う実験とRNAワークを同じ場所や器具でやるべきかということについては否定的な意見が多いように見受けましたが（私もそういう環境で作業したことはありませんでしたが、その必要性を感じません）、自分のなかにある答えにかなう意見しか聞こえないということでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.2452-8 - 2013/10/14 (月) 12:10:14 - RN汗 皆様、御助言をありがとうございます。 当方のグループは、手狭な空間を、学生、留学生、教官が共通のベンチを共用しています。 フィルターチップのみを使い、実験台の上にサランラップを敷いていました。 ですが、改めて考えると、氷をいれるアイスボックス、ピペットマン、オンアイスで使うアルミブロックのマイクロチューブ立て、遠心機のロータ、アルミヒートブロックなどは、RNaseを使うユーザーと共有していました。またこれらの道具や実験台を、RNase除去剤で綺麗にするということもしていませんでした。これらの点を改めたいと考えています。 もうひとつ皆様の御意見を教えてください。当方では、タカラバイオのRNAiso Plus（TRizolとほぼ同じ？））で抽出し、乾燥させたRNAを、RNaseフリー水で溶解しています。これにRNase inhibitorを添加した方が良いでしょうか？　 といいますのは、cDNAの合成には、東洋紡のReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Removerを使っています。そして、RNAの状態での65℃５分のインキュベーション、氷上で急冷、DNase処理といった、cDNA合成反応よりも前の段階では、RNase inhibitorが全く無い状態になるため、いつも不安に感じています。タカラバイオのキットから、東洋紡のキットに移動するので、ギャップを埋める情報が不明な次第です。 なお東洋紡のReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Removerの詳細は次です。 http://www.bio.toyobo.co.jp/bio01/file/FSQ-301.pdf また手元には未開封の次のRecombinant RNase Inhibitorがあります。 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?catcd=B1000345&subcatcd=B1000376&unitid=U100006137

(無題) 削除/引用 No.2452-7 - 2013/10/13 (日) 23:09:48 - AP エバポレータって沈殿を乾燥させるため？ それやっている方が四半世紀は時代遅れんじゃないか？ 今や自然乾燥が常識的になっていると思うけれど。

(無題) 削除/引用 No.2452-6 - 2013/10/13 (日) 21:25:19 - ぺーぺー >[Re:5] んぐさんは書きました : > ただ、実験台の上やピペットを気にする人は多いですが、カラムのスピンダウンに > 使う遠心機の中を気にする人は意外に少ないです。 横から失礼します。 蓋をする遠心装置を気にしたことはあまりありません。 それよりも、エバポレーターの共用が気になりました。 RNA用のエバポレーターを用意しているラボもありましたが、そこまで余裕のあるラボは少ないんじゃないかと。 結局、存在に気づかず使っていなかった訳ですが。

(無題) 削除/引用 No.2452-5 - 2013/10/13 (日) 20:56:10 - んぐ 別の部屋を使うように言われていたのは、粉末のRNaseを扱うところではない かと思います。蓋をあけると結構な量が飛散してる気がします。 液体にしてしまえばそんなにコンタミが気になるようなことはないはず。 ただ、実験台の上やピペットを気にする人は多いですが、カラムのスピンダウンに 使う遠心機の中を気にする人は意外に少ないです。

(無題) 削除/引用 No.2452-4 - 2013/10/13 (日) 02:23:21 - おお ピペットマンは同じものを使っていても、経験上RNAはあつかえていますし、実験でつかうRNaseAより環境に存在するRNaseの方が、要注意だと思います。気になるなら専用のピヘットマンを用意してもいいですし、フィルター付きのチップも助けにはなるとおもいます。もちろん実験でつかうRNaseAは環境にみいだされるものより高濃度でありますが、それを実験台に塗るわけでもありませんし。たとえはplasmidをRNaseを使いながら精製して、そのplasmidをつかって、RNAを合成したりすることもありますし。 ピペットのチップなどRNAで使うものはわけるとか、RNAを使うときは新しいものをおろして、のこったものはそれ以外の実験に回すとか、あるいは専用にチップをキープするとか、試薬はRNA専用のものをよういして、それ以外に使わないとか(いまはキットで試薬がそろうので、ほぼすべて専用の試薬がそろいますが)、 もしやっていなければ、RNAの実験の時は実験台、ピペットなどのコンタミの除去からはじめるといいかとおもいます。こんたみ除去用試薬など出回ってますが、H2O2 (3%以下)でも有効です。そういうもので実験台などを拭いたりしてからはじめればいいかと。ピペットは表面はそう言うもので拭けますが、先端の部分の内部がこんたみしているなら、パーツをばらして、除去および失活させることが必要かと思います(そのかわりに、filterつきのtipを使うとそこまで厳密な処理はひつようないかもしれません)。

(無題) 削除/引用 No.2452-3 - 2013/10/13 (日) 02:13:45 - ぺーぺー >[Re:1] RN汗さんは書きました : > 当方、プラスミドをカラム精製（ミニやミディでRNase入り）する者と、RNAをRNAiso plus等で抽出する者が同居せざるを得ない状況になっています。 ・はい。分子生物学的手法を採用している多くの研究室は、そんなものだと思いますよ。 > 以前は、RNA抽出してRT-PCRやリアルタイムPCRだけをしていまして、うまくワークしていました。ところが、プラスミドのカラム精製をするようになってから、RT-PCRなどがワークしなくなってきました。 ・こういう風に書かれると、「そうですか。じゃあ、それが疑わしいですね」と言わざるを得ませんね。でも本当にそうなんですか？ 例えばキットを使うようになってからRNAワークが上手く行かなくなるまで、どのくらいの期間があるのでしょうか。 次の日からですか、一週間後でしょうか。まさか、一ヶ月後とか言う事はないですよね。 > 教科書的には、RNaseを使う部屋は別室といったことが書かれていますが、そういったことはできない状況です。どうしたら良いでしょうか？ > > またカラム精製のRNaseで部屋がコンタミしているとした場合、どうしたら清浄にできるのでしょうか？ ・対策の具体的な例では…… (1)手袋をする (2)アルミホイルを敷く (3)フィルター入りチップをRNA専用にする。 (4)マイクロピペットをRNA専用にする。 (5)DEPC処理水を使用する。 この内(1),(5)については概ね守っています。 他はやったりやらなかったりです。 何れの対策についても殆ど信じていません。 つまりはキット等を共有する同僚に不快感を与えない配慮に過ぎません。

(無題) 削除/引用 No.2452-2 - 2013/10/13 (日) 01:00:49 - 独り言 すべての研究員、学生が共通のデスクを使用しているラボということでしょうか。 一人一つの実験デスクが与えられ実験するラボに何度か所属してますが、その場合は、一つの自分のデスクでミニプレもRNA抽出もします。RNA抽出する場合は、一応RNA用に別のチップを用意したり、アルミホイルを机に敷いて、その上で行ったりしてます。ピペットマンは同じです。すくなくとも同じデスクで行ってRNAseがコンタミしたと思った事はありません。 それともそのミニプレを行っているヒトは、ミニプレの液を飛び散らしながら実験してしまうようなヒトなのでしょうか。部屋がコンタミとはいっても、空気感染するわけではないので、部屋中ということはないでしょう。まずは、RNAがちゃんととれているのかどうか、RNAを泳動してみてみてはいかがでしょうか？

プラスミドのカラム精製（RNase）とRNA抽出の同居 削除/引用 No.2452-1 - 2013/10/12 (土) 23:30:30 - RN汗 よろしくお願いします。 当方、プラスミドをカラム精製（ミニやミディでRNase入り）する者と、RNAをRNAiso plus等で抽出する者が同居せざるを得ない状況になっています。 以前は、RNA抽出してRT-PCRやリアルタイムPCRだけをしていまして、うまくワークしていました。ところが、プラスミドのカラム精製をするようになってから、RT-PCRなどがワークしなくなってきました。 教科書的には、RNaseを使う部屋は別室といったことが書かれていますが、そういったことはできない状況です。どうしたら良いでしょうか？ またカラム精製のRNaseで部屋がコンタミしているとした場合、どうしたら清浄にできるのでしょうか？

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