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(無題) 削除/引用 No.2469-17 - 2013/10/20 (日) 18:32:16 - おうお PMID: 17332513 ものにもよるでしょうけど、 「トリプシンと比較して」という言葉がつけば、「FACS用には、TrypLEを...」と言うこともありか。

(無題) 削除/引用 No.2469-16 - 2013/10/20 (日) 15:24:56 - おお >[Re:13] おうとさんは書きました : > 40倍程度に希釈したところで、はがれてくる細胞数が減少している。反応時間などは不明。0.1Xでは1Xと同じくらい細胞をはがす力があるらしい。 > なるほど。。。fig10の実際のプロトコールが気になるところですね。。。希釈で不活性かとかいているのは、けいだいのプラクティカルな培地を使ったものなのか、活性測定のためにPBSで希釈しただけの場合のことなのか、、、

(無題) 削除/引用 No.2469-15 - 2013/10/20 (日) 15:18:09 - おお >[Re:12] おうとさんは書きました : > >またFACS用には、細胞表面の抗原が切断されたくないのでTrypLEで処理します・・・ > http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1326 > > 商品の謳い文句をそのまま受け入れれば、TrypLEは精製度が高くコンタミのプロテアーゼが少ないので、トリプシン切断サイトが無いものについては細胞表面の抗原が保存される、ということでしょうか。 トリプシン切断サイトがないたんぱくがどの程度あるかというと、、、massでちょうどいいぐらいのペプチドをつくるので重宝されているこうそですからねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.2469-14 - 2013/10/20 (日) 14:37:51 - さ ディッシュから培地を除いたあとPBSでリンスしてありますよね。 ディッシュにトリプシンを加えて全体に行き渡らせたあと、すぐにトリプシンを除いても、３７Cインキュベーターに入れておくと細胞は剥がれます。そこに培地を加えれば、量はずっと減らせると思います。 １０ｃｍディッシュで２ｍLは多くないですか？

(無題) 削除/引用 No.2469-13 - 2013/10/20 (日) 14:03:45 - おうと >希釈するだけで不活性か tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/O-13047_Tryple.pdf の図6 40倍程度に希釈したところで、はがれてくる細胞数が減少している。反応時間などは不明。0.1Xでは1Xと同じくらい細胞をはがす力があるらしい。

(無題) 削除/引用 No.2469-12 - 2013/10/20 (日) 13:57:55 - おうと >またFACS用には、細胞表面の抗原が切断されたくないのでTrypLEで処理します・・・ http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1326 商品の謳い文句をそのまま受け入れれば、TrypLEは精製度が高くコンタミのプロテアーゼが少ないので、トリプシン切断サイトが無いものについては細胞表面の抗原が保存される、ということでしょうか。 >Gentle on cells >TrypLE™ Express' exceptional purity increases specificity due to the action of a single enzyme. This reduces damage caused by cleavage from multiple enzymes in trypsin and other extracts. A Protocol for Cell Detachment of Vero Cells Grown Under Fully Animal Component Free Conditions and on Cytodex 1 Microcarriers この文章みるとsoybeanのインヒビターで阻害されそうな感じ。

(無題) 削除/引用 No.2469-11 - 2013/10/20 (日) 03:07:30 - おお 前のリンクでは希釈するだけで不活性かされるとかかれていましたので、そのまま不活性化するともうしあげています。学術的根拠についてはとくにさがしてませんが、、、 Easy to Use TrypLE™ Express can be directly substituted for trypsin in existing protocols. In addition, dilution alone "inactivates" TrypLE™ Express, avoiding the need for trypsin inhibitors, such as FBS.

(無題) 削除/引用 No.2469-10 - 2013/10/20 (日) 01:31:50 - おお >[Re:9] りんごさんは書きました : > >[Re:8] おおさんは書きました : > > > TrypLEは薄めるだけで失活するといううたい文句なので、こちらの方が安全かもしれません。 > > > TrypLEは微生物由来のトリプシン様酵素なので、血清入り培地とかトリプシンインヒビターで阻害できない。だから細胞に影響がない濃度まで薄めて継代してください（メーカーとしてはトリプシンより細胞に与えるダメージは低いことを確認している）といううたい文句だと思います。 Figure 10. MDCK cell dissociation without washing or the use of trypsin inhibitors. Cells were not washed following dissociation and no protease inhibitors were used. Morphology was observed 24 hours later. While 1mM EDTA was needed for TrypLE™Express to remove cells, protease inhibitors were never needed to preserve cell viability or plating efficiency. In fact, use of inhibitors reduced viability and growth rate at some concentrations. trypsin inhibitorsが効かないという情報は見つからないですが、そうなんでしょうか。 おしめしの文献Fig10では洗浄なしで細胞にダメージを与えないとかいてます。 細胞に影響がない程度にうすめるということですが、トリプシンほど薄める必要はないという感じではないでしょうか。確かに過信すべきではないとはおもいますけど。 FACSの件は私も怪しいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2469-9 - 2013/10/20 (日) 00:55:02 - りんご >[Re:8] おおさんは書きました : > TrypLEは薄めるだけで失活するといううたい文句なので、こちらの方が安全かもしれません。 TrypLEは微生物由来のトリプシン様酵素なので、血清入り培地とかトリプシンインヒビターで阻害できない。だから細胞に影響がない濃度まで薄めて継代してください（メーカーとしてはトリプシンより細胞に与えるダメージは低いことを確認している）といううたい文句だと思います。 ですので失活というよりは、影響が低いと考えるほうが良いと思われます。 http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/O-13047_Tryple.pdf またFACS用には、細胞表面の抗原が切断されたくないのでTrypLEで処理します・・・と記載された文章を見たことがありますが、どうもその情報は怪しいものと思われます（偶然その抗原は大丈夫だった・・・というレベルの情報と思われます）

(無題) 削除/引用 No.2469-8 - 2013/10/19 (土) 13:34:05 - おお わたしもトリプシン処理後そのまま培地にけんだくして直接まきますが、質問をみてトリプシンの持ち込みもう少し少なくならんかなぁというのが私の印象です。 2mlくわえて、はがれそうになってきたなら、はがれる前にほとんど吸い取るとか。わたしは10cmdishならtrypsin 0.5mlwashで吸い取ってさらに0.5mlでいまやってます。 TrypLEは薄めるだけで失活するといううたい文句なので、こちらの方が安全かもしれません。 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12605010?CID=Search-12605-010 ちなみにわたしも遠心してトリプシンをのぞいてからけいだいするように最初に教わったので、大昔にですがそれをスキップする方法はちょっとびっくりしたことがあります。そうやって飼っている細胞で遠心にあまり強くなかったりするようなきもしてます。全部じゃないけど

(無題) 削除/引用 No.2469-7 - 2013/10/19 (土) 12:19:46 - qq わたしは、0.1%トリプシン（PBS/EDTA） 1mlで10-cm dishの細胞をはがして、その1/10-1/20量を10mlの10％FBS入り培地に撒いています。あなたの条件と比較すると12倍から25倍少ないトリプシンの持ち込みです。剥がれにくい細胞の場合は、一度、トリプシン溶液を加えて1分程度おいて、トリプシンを除去した後で、もう一度トリプシンを添加します。 この条件で1/10希釈程度あれば、あまり違和感のない細胞培養ができているように思います。（細胞の種類と条件に依存しますから、自分で条件を考えないといけません。） もっと濃い状態で植え込みたい時、私は、 1）そのまま、細胞を撒いて、ちゃんと接着したところ（半日程度）で、培地を交換する。 2）お行儀よく遠心して、うえこむ。 のいずれかを選択します。 特にあなたの継代条件はかなり濃い目ですから、「大丈夫」というほど大丈夫には思えません。

(無題) 削除/引用 No.2469-5 - 2013/10/19 (土) 10:44:56 - おうおう なるほど、皆さんそうされているのですね。 不安が解消され大変参考になりました。 ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.2469-4 - 2013/10/19 (土) 10:15:32 - AA 血清中のグロブリンなどのタンパク質によってトリプシンの活性は失われるはすなので、大丈夫だと思います。 私も習った当初は、 トリプシン→FBS培地→遠心→PBS→遠心→FBS培地、 とやっていましたが、時間がかかるので一般的な株化細胞の継代ていどであればやらなくなりました。 細胞数を数えたいときや初代培養を継代しないといけない時は洗ってます。

(無題) 削除/引用 No.2469-3 - 2013/10/19 (土) 00:04:47 - 独り言 ほとんどのラボがトリプシン込みでケイダイしていると思います。 大抵の細胞は大丈夫です。

(無題) 削除/引用 No.2469-2 - 2013/10/18 (金) 23:11:07 - TS 細胞にもよると思いますが、大丈夫な細胞も少なくないでしょう。 私も同様の方法で継代することが多いです。

トリプシンについて 削除/引用 No.2469-1 - 2013/10/18 (金) 20:19:19 - おうおう 細胞実験初心者です。 いまラボのヒトに培養・継代を習っているのですが、１０ｃｍディッシュの線維芽細胞を２ｍｌトリプシンで剥がしたあと、１０％FBSの培地８ｍｌで中和していおります。 教科書などを見るとそこで遠心をかけて上清をすてて新しい培地で懸濁すると思うのですが、うちのラボはそのまま１：４に継代してしまいます（トリプシンが入った状態で） 最終的にはトリプシン0.5mlが計10mlの培地に入った状態になっているわけですが、トリプシンは理論上中和されているとはいえ大丈夫なのでしょうか？ （FBSの濃度が変わるという問題は別にして） また同じようにやられている方はいらっしゃいますでしょうか？

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