BioTechnicalフォーラム [アガロースゲルから回収したプラスミドで、形質転換効率が悪い。]

(無題)

No.2507-23 - 2013/10/30 (水) 19:34:28 - 独り言

UVっぽいですが、他の可能性としてはアガロースは大丈夫でしょうか？アガロースの純度によっては不純物が混じっているのでよくないかも。主にライゲーションを阻害しますが、安価なアガロースだと大腸菌内でも影響するのかも。

(無題)

No.2507-22 - 2013/10/30 (水) 17:16:00 - AP

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>（どこかの機器、試薬メーカが、自社製品の宣伝のためUVの影響をデモする実験の写真をだしているのを見たこともあります）

たとえば、
http://www.lifetechnologies.com/jp/ja/home/life-science/dna-rna-purification-analysis/nucleic-acid-gel-electrophoresis/gel-documentation/blue-light-transilluminator.html

http://www.clarechemical.com/cloning.htm

(無題)

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No.2507-21 - 2013/10/30 (水) 16:48:55 - Jacob

みなさまご回答ありがとう御座います m(_ _)m

しばし忙しいので今は、簡潔に。

＞おお様
＞希釈してチューブに分注したプラスミドにそのイルミネーターでUVを照射して、形質転換効率にどのように影響するか確認してみてはどうですか。

は今日、試してみようと思います。

また、次実験するときに、

＞せみ様
＞泳動した後でプラスミドをかすめるようにゲルを切り取り、UVを当てて目印をつけておき、それをもとのゲルと合体させて切り取れば一度もUVを当てること無く切り出すこともできます。

を実践してみようと思います。

なんだか UV によってそんなに影響を受けると思っていなかったものですが、
みなさんが声を揃えて UV だと言われるので　(；´Д｀)ﾊｱﾊｱ　して居ります。

結果が出たら、またお知らせしようと思います。

(無題)

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No.2507-20 - 2013/10/30 (水) 16:40:29 - AP

>UVもきになるんですけど、ライゲーションの時のプラスみドの量と、加えたおりごの量比はどうなってますか

No.2507-7 にもあるように、
>ところがあまりコロニーが生えて来ないので、原因を探すために、
ベクターのプラスミドをそのまま流して回収してみることをやったのですが、
この段階で上手くいかなかったという訳です…。

というわけで、それ以前の問題。

(無題)

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No.2507-19 - 2013/10/30 (水) 16:34:39 - おお

UVもきになるんですけど、ライゲーションの時のプラスみドの量と、加えたおりごの量比はどうなってますか?例えば5kbpのプラスみドに25bpのインサートいれるなら、50ngのぷらすみどに1ngのおりごを混ぜれば十分で10ngオーダーでおりごをいれるとtransformationの効率は激減しますし。

もしかしてゲル切り出し必要ないのではないかともおもえたり、ぷらすみどをphosphatase処理しておいて、おりごをリン酸化するとか。短いだけにタンデムがきになりますけど。

もし、プラスみどを切る場所の間にもう一つユニークな制限酵素認識部位があるなら、まずそれできって、脱リン酸化してさらに目的の酵素できればコンパチブルなエンドができてない限り、もとの配列は入らない(入るチャンスがおりごよりも格段にひくい)でしょう。

(無題)

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No.2507-18 - 2013/10/30 (水) 15:54:46 - み

Gene clean kitの説明書の内容を一応貼り付けておこう。
まあ今回の問題はUVの当てすぎによる可能性が高いけど・・・。

Common Questions：
Do I need to do anything different when using the GENECLEAN® Kit with high molecular weight DNA (>10 kb)?

Shearing can be a problem for high-molecular-weight DNA, but may be minimized by doing the following:
1. Use a wide-bore pipet and minimize agitations of the GLASSMILK®/DNA pellet. For the wash steps,
allow the GLASSMILK® pellet to soak in the NEW Wash instead of resuspending it. When eluting, gently
resuspend the pellet using a wide-bore pipet.
2. Use SPIN Modules (Cat. #2080-800) with the GENECLEAN® Kit to avoid shearing the DNA while it is
bound to the GLASSMILK®.

(無題)

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No.2507-17 - 2013/10/30 (水) 15:44:10 - み

>[Re:15] APさんは書きました :
> >それはDNAの断片化を少なからず招くでしょうから、
>
> それは嘘だ。よっぽど長いDNAでなければ(たとえば20 kb）でなければそんなこたあない。

うん、済みません。自分でも投稿した後、「断片化」という言葉は不適切だと思った。回収後、泳動すればintactなサイズであるのは確認できるからね。
でも修復不可能な傷とか入らんのかな？

(無題)

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No.2507-16 - 2013/10/30 (水) 15:37:52 - 中年

365nmならば形質転換効率1/1000というのはちょっと変な気がしますが、UVイルミネーターのフィルターが古くてダメになっているとか、不良品だとかいうこともあるかもしれません。希釈してチューブに分注したプラスミドにそのイルミネーターでUVを照射して、形質転換効率にどのように影響するか確認してみてはどうですか。

(無題)

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No.2507-13 - 2013/10/30 (水) 15:35:08 - AP

UVによる悪影響はnickingによるものが主ではありません。ピリミジンダイマー形成によりレプリコンの複製がストップすることです。これは組換え実験で使われる多くの宿主がそうであるようにRecA-の性質です。

例えば、cccのプラスミドをUVたっぷり当てて切りだし精製したものを泳動してみてもnickによってOCがむちゃくちゃ増えているようには見えないでしょう。また、nickがあったとしても宿主に修復系があります。脱リン酸化ベクターを使うとligationあとにnickを残しますが、それでもちゃんとworkすることからもわかるでしょう。
それでもUV照射後は形質転換効率はケタ違いに下がります（どこかの機器、試薬メーカが、自社製品の宣伝のためUVの影響をデモする実験の写真をだしているのを見たこともあります）。
どのていど影響するかは、装置ごとの波長、強度の違いや照射時間によってことなりますが、どんなにマイルドな条件でも無傷ではすみません。非常に「性能のよい」照射装置だと短時間の照射下での切り出し作業でもまったくno colonyになってしまうこともあります（経験あり）。できることならUVは完全に当てないにこしたことないです。

(無題)

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No.2507-12 - 2013/10/30 (水) 15:32:50 - み

>[Re:9] Jacobさんは書きました :
> (前から)
>
> UVに関しては、確かにちょっと当てている時間は長いかもしれません。
> 365 nm の波長で、2~3分程かかっていたと思います。

２分って何故そんなに時間かかるのでしょうか？
５秒くらいで済ませた方が良いでしょう。
うちのラボのUVは長波長設定が無いので５－１０秒でもアウトでした。
状況を打開するためにアクリル板を１枚かませてUVの影響を弱めたら解決しました。
365nmなら数十秒当てても大丈夫かもしれんけど２分はありえない。

あとGene cleanってガラスの破片で回収するやつでしたよね？
それはDNAの断片化を少なからず招くでしょうから、そこでも効率は落ちますよね？
僕は過去にGene cleanから羊土社のイラストレイテッドシリーズ本に掲載されているTE飽和phenolでの簡易抽出に切り替えただけで効率が凄く上った経験あり。

(無題)

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No.2507-10 - 2013/10/30 (水) 14:40:37 - おお

ライゲーションしたオリゴが大過剰だったり、うまくアニーリングしてなかったりという可能性がないですか。

私は10まー位のランダムの配列を挿入するためにインサートする部位からまるごとプラスみドを増幅するプライまーにランダムな配列を5'側につけて、プラスみドを増幅後、リン酸か、セルフライゲーションをしたことがあります。

(無題)

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No.2507-9 - 2013/10/30 (水) 14:26:02 - Jacob

(前から)

UVに関しては、確かにちょっと当てている時間は長いかもしれません。
365 nm の波長で、2~3分程かかっていたと思います。
ちなみに染色は、Gel Red　を使っています。

しかし、
＞それにしてもコロニー数個というのは異常なのでは？
とも個人的にも思ったりしてます。

とは言え、UV照射によってどのぐらい影響が出るものなのか
あんまり理解していなかったりするので、その辺り解るものがあれば
ご教授頂きたく m(_ _)m

(無題)

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No.2507-8 - 2013/10/30 (水) 14:18:21 - Jacob

＞AP様
＞UV当てたから

＞せみ様
＞APさんの言うとおりUVを当てすぎてはないですか？

＞taichi様
＞Jacobさん、検出（染色と励起）は何でされてますか？

に答えます。

(続きます…)

(無題)

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No.2507-7 - 2013/10/30 (水) 14:14:10 - Jacob

(前から)

そのために、たくさんのコロニーを得る必要がある訳です。

ところがあまりコロニーが生えて来ないので、原因を探すために、
ベクターのプラスミドをそのまま流して回収してみることをやったのですが、
この段階で上手くいかなかったという訳です…。

＞せみ様
＞選抜マーカーの種類や濃度が間違っているのでは？

恐らくその点は大丈夫だと思います。
ゲルに流す前のプラスミドを菌に形質転換すれば、かなりの量のコロニーは得られること。また、
上の実験で書いたように、オリゴヌクレオチドをライゲーションしたものも、少しはコロニーが
生えていまして、そこからプラスミドを回収し、シークエンスで配列を読んだところ狙ったところに変異がちきんと入っていることは確認しています。

(無題)

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No.2507-5 - 2013/10/30 (水) 14:06:18 - Jacob

早速の返答ありがとう御座います m(_ _)m

＞AA様
＞ちなみになぜ環状プラスミドをゲル精製してそのまま形質転換する必要があるのか

なのですが、話すと長くなりそうなので前置きを省略していましたが、
事の経緯をもうちょっと詳しく書きます。

本来やりたいことは、制限酵素で切って分離したベクターに、
オリゴヌクレオチドをアニールさせて作った配列を挿入するというのもです。
ちなみに、このオリゴヌクレオチドはランダム変異を複数入れており、
これをライゲーションすることで、多くの微妙に異なる変異の入ったプラスミド
のライブラリーをたくさん作りたい、という実験計画があります。

(続きます。)

(無題)

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No.2507-4 - 2013/10/30 (水) 13:56:32 - せみ

数マイクロ流して視認できるほどならば量としては十分なので根本的なミスだと思われます。
APさんの言うとおりUVを当てすぎてはないですか？
泳動した後でプラスミドをかすめるようにゲルを切り取り、UVを当てて目印をつけておき、それをもとのゲルと合体させて切り取れば一度もUVを当てること無く切り出すこともできます。

それにしてもコロニー数個というのは異常なので、選抜マーカーの種類や濃度が間違っているのでは？

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