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(無題) 削除/引用 No.2540-6 - 2013/11/14 (木) 12:21:23 - はる みなさん貴重なご意見ありがとうございます。 >おおさん 主に結果の補足に使う実験ですので、放出活性実験条件に近づけた系を優先的に行うことにしました。 ありがとうございました。 >~さん 添加回収実験に関しては知識がないのでこれから勉強しようと思います。 細胞毒性に関しては他の系でも検討する予定です。 >TK-1 説明不足で申し訳ありません。 MTTでは綺麗なシグモイド曲線を描いていること、鏡検と測定値のギャップがみられないことから、MTT assayに問題があるとは考えにくく、LDH放出試験に問題がないかを優先的に検討しています。 ご指摘の通り、本来の目的からは逸れていますが、今回の結果を補足し、考察に足りうるデータが欲しいという上の意向を酌んで、同様の現象を確認している文献に倣いデータを集めているというところです。 ですので当然細胞毒性に関しても他の系で検討する予定です。 LDH放出試験ではLDHの酵素活性を用いて測定しています。 LDH量変化に関しては、キットの総LDH活性測定を用いて放出LDH活性と比較し検討する予定です。 本来であればこちらを先に行ってから考えるべきなのでしょうが、 事情により今回は総LDH活性とLDHの酵素安定性を同時に試験するため、 試験物質の酵素影響を見るプロコトルを詰めていたところです。 話が分かりづらくなってしまっては元も子もないので、 今回はLDH酵素活性のプロトコルに関して絞って質問させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.2540-4 - 2013/11/14 (木) 03:23:31 - TK-1 元々、この試薬の濃度が高いときにMTT assayがおかしくなったと言う可能性はないんですか？ あと、仮にこの試薬がLDHを阻害することがわかったとして、そこからどこに向かうんですか？何か、本質的に何のために何を明らかにしたいのかよくわかりません。元々調べていたのはこの試薬の毒性であり、そこからMTT assayとLDHの活性（それとも量？）の乖離があるらしいと言うことになり、そこで何故この試薬とLDHの活性阻害の話に行くのか？？？？？LDHの放出と言うのは活性のことですよね？？ あまり失礼なことを言う気はありませんし、もちろん予期しないところから大発見が生まれることもあるかもしれませんが、サイエンティストなら実験の目的、予測される結果とその考察、その結果をどのように次ぎにつなげるかは考えた方が大事ですし、それを人に説明できないと困りますよ。いくら、他の人がLDHの活性に関するコメントをつけてくれても、活性をはかることに意味がなければ決して結果にはつながらないと思います。せめて、この試薬で酵素活性が下がっていることを示したいのであればLDHの量を測定して量の変化による影響でないことは示す必要があります。そのため質問にあたって、あなたのおっしゃる"試験物質が高濃度になるとLDH放出量"と言うのが具体的にどのように測定されたものであるのかははっきりさせる必要があります。

(無題) 削除/引用 No.2540-3 - 2013/11/13 (水) 09:30:31 - ~ 1つのセルライセートを分注して試験物質の濃度を振って加えた物を用意し、 ポジコンLDHの添加回収実験をするのも手かもしれません。 それで影響が見れれば、試験物質が直接であれ間接であれLDH活性に影響するのでしょうから、 何がLDH活性に影響するかを調べるよりも、他の細胞毒性を調べる方法を調べたほうがメインのテーマを進めるにはよいかと。 もしくは、LDH活性と試験物質の関係を調べるのではなく、違う原理の細胞毒性を調べる方法を用意して、そちらで裏付けのデータを取った方が効率がいいのかもしれません。 両者で同じ傾向の結果が得られるのであれば、それぞれの測定系に違う原理で試験物質が悪影響を与えている可能性は低いと考えられるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2540-2 - 2013/11/13 (水) 01:51:39 - おお もし、LDHへの直接的な影響をみるならなるべくシンプルな方がいいかとおもいます。ただし、LDHの活性があなたの実験の状況で落ちてくることの説明なら、実験条件に近い方が説得力があるばあいもあります。 まずどちらを優先するのかで決まるのでないでしょうか。たとえばその薬剤が培地の血清成分などプロテアーゼを活性化させるためLDHが分解されるとかになると、培地成分がないとかっせいよくせいはみれないですから。 同時にそういうことは、シンプルな系と両方見ないと直接か間接かわかりません。また直接か間接かが重要でなくLDHの活性が落ちる説明を求めているだけならシンプルな系は必要ないともいえます。

試験物質がLDHの酵素活性に与える影響を見たい 削除/引用 No.2540-1 - 2013/11/12 (火) 15:30:20 - はる 試験物質の細胞毒性をLDH放出により測定しようとしたところ、 一定濃度まではMTTの細胞生存率と濃度依存的な相関を示すLDH放出が見られたのですが、 試験物質が高濃度になるとLDH放出量が落ちてくるようになりました。 こういった理由から、試験物質がLDHの酵素活性自体に与える影響を見たいと考えています。 放出試験キットのポジコンLDHを用いて、無細胞条件で測定しようと考えているのですが、 この場合サンプルの希釈には細胞毒性試験に用いた培地を使ったほうがいいのか、 それともポジコンLDHの希釈に用いる(1%BSA)PBSを使ったほうがいいのか分かりません。 分野外のため拙い説明で申し訳ありません。 何かアドバイス頂けると助かります。

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