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(無題) 削除/引用 No.2544-15 - 2013/11/13 (水) 23:28:04 - おお >[Re:14] みのさんは書きました : > なるほど。探してみたらT7はあったのですが、CMVなどはなかなか見つからず。 > でもin vitroの翻訳はPCR産物をテンプレートに使われるなと思いました。 まんまるの発現用でした。PCRによるエラーもあるし、ましてや発現するのかとおもったので覚えています。

(無題) 削除/引用 No.2544-14 - 2013/11/13 (水) 19:45:48 - みの >[Re:9] おおさんは書きました : > 方法論としてあると申し上げましたが、プロモーターの配列のタグがついたプライまーでそのままPCRして、トランスフェクションするというようなものがたしか商品化されていたのをみたことがあります。 なるほど。探してみたらT7はあったのですが、CMVなどはなかなか見つからず。 でもin vitroの翻訳はPCR産物をテンプレートに使われるなと思いました。

(無題) 削除/引用 No.2544-13 - 2013/11/13 (水) 18:08:19 - みの みなさんコメントありがとうございます。 DSBになる様な気もしますが、逆にDSBの研究でこのような方法が使われていないと思うので、そこまで効率的なDSBの認識ではないのかなと思ったり。でもみなさんがご指摘するような何らかの問題があるのか、少なくとも単純な方法の割にはこのような方法で発現量を上げている方はいないことから、あまり意味のないことなのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2544-12 - 2013/11/13 (水) 15:44:16 - AP PCRによるエラーは、この場合どの程度インパクトがあるのかしらん。 条件にもよろうが、すべてのDNA分子がエラーをもつわけでなく、エラーの位置もばらついたものの混合物であるはずなので、単一DNA分子をクローニングしてエラーがあった、なかったというようなのとはわけが違うかと。 そもそもRNA polymeraseは校正活性がないのでerror proneじゃなかったっけ?　（つまり正確なDNA配列であってもできる転写産物はエラーがありがち）

(無題) 削除/引用 No.2544-11 - 2013/11/13 (水) 15:03:07 - AP >安定発現株はlinearの方がいいと言われていますし、 >ステーブルの場合はリニアーなDNAの方が発現量が高い株が得られる傾向が見られますが、 言わずもがなでしょうが、それもDNA末端がDSBになっていることから来ていて、組換え修復系を誘発して染色体に組み込まれやすいということですけれど。 でも、そのことから、染色体に組み込まれていないフリーのlinear DNAも同じように発現するかどうかは言えないんじゃないでしょうか。例えば、DSB修復系の酵素が取り付くことによって転写が阻害されるとか、両端がDBSであることで自由に二重らせんが緩むDNAと、そうでない環状のDNAや染色体に組込まれたDNAでは鋳型としての活性、利用効率などが違うとか。わかんないけど。

(無題) 削除/引用 No.2544-9 - 2013/11/13 (水) 13:21:21 - おお 方法論としてあると申し上げましたが、プロモーターの配列のタグがついたプライまーでそのままPCRして、トランスフェクションするというようなものがたしか商品化されていたのをみたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.2544-8 - 2013/11/13 (水) 13:13:48 - ~ あれ？トランジェントの発現の話ですよね？ ステーブルの場合はリニアーなDNAの方が発現量が高い株が得られる傾向が見られますが、 トランジェントでもリニアーDNAの方が発現がいいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2544-7 - 2013/11/13 (水) 12:15:32 - おお circularのプラスミドを入れたとしても、circularで維持されているとおもえませんけどねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.2544-6 - 2013/11/13 (水) 12:07:45 - mini >[Re:5] ~さんは書きました : > DNAの末端が細胞内に多量にあるのは大丈夫なんですかね。 > DSBとして修復やアポトーシスに向かうと、転写どころではなくなるかも。 昔から、安定発現株はlinearの方がいいと言われていますし、実際に多くの実績もあるわけなので、その辺は大丈夫ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2544-5 - 2013/11/13 (水) 09:38:37 - ~ DNAの末端が細胞内に多量にあるのは大丈夫なんですかね。 DSBとして修復やアポトーシスに向かうと、転写どころではなくなるかも。

(無題) 削除/引用 No.2544-4 - 2013/11/13 (水) 08:52:54 - mini 大腸菌で増やした場合でも、minicircle DNAとかキット化されてますね。 すでに指摘がありますが、酵素の性能がよくなったとしてもPCRはエラーが入る可能性が大腸菌で増やすよりもまだ高いし、長くなれば長くなるほどエラーが入りやすくなりますよね。 あと、よい酵素はより高いし、あまり一般受けしなそうです。 そういう意味で、現時点の技術では大腸菌で増やした方が安心なのかな。

(無題) 削除/引用 No.2544-3 - 2013/11/13 (水) 08:37:30 - TS あり得るとは思います。 確かに長さが短くなることで効率が上がる可能性が高いですが、circularの方が入りやすいリポフェクション試薬があったりするかもしれません（想像）。半分の長さになれば2倍になるとはいかないんじゃないかなぁ。 それと、PCRだとPCRエラーの問題が残りますね。 めんどくさくなければ、必要な部分だけ制限酵素で切り出して精製し使うこともできます。安定株をとる時には類似の方法を好んで行う人がいると聞きます。

(無題) 削除/引用 No.2544-2 - 2013/11/13 (水) 03:32:19 - おお 発現効率は見劣りがするかもしれません(すいませんこれは個人的な印象です)が、方法論としてはやられているとおもいます。

プラスミドとPCRのトランスフェクション効率 削除/引用 No.2544-1 - 2013/11/13 (水) 02:36:19 - みの 一般的に、培養細胞にタンパク質を過剰発現させたいときは、プラスミドをトランスフェクションしますが、発現量は導入されるプラスミドの量に依存すると思います。でもトランスフェクションできるDNA量には限度があります。 用いているプラスミドは無駄な領域（アンピシリン遺伝子や骨格領域）があるので、プロモーターからポリAまでの領域をPCRで増幅させて精製すれば、DNAの長さは半分になります。なのでプラスミドと同じ量のPCR産物をトランスフェクションしても２倍の濃度でプラスミドを導入できることになります。 そうであれば、タンパク質の発現量もより上がると思うのですが（またプラスミドを増やすよりもPCRの方が楽）、そういった方法は一般的におこなわれているのでしょうか？ よろしくお願いします。

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