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(無題) 削除/引用 No.2545-4 - 2013/11/13 (水) 18:31:14 - Winter8 thrombin処理は室温とありますが、精製は低温でしょうか。 >その結果、白色の沈殿ができ、 上清と沈殿をそれぞれSDS-Pageすると蛋白は殆ど沈殿の方にありました。 また、目分量でGSTは1割程度しか目的蛋白から外れていませんでした。 ということですので、thrombin処理される前に沈殿した可能性が高いようです。 沈殿したこととthrombinとは直接関係ないように思えます。 まずは、室温に一晩静置した点について、検証してみてはいかがでしょう。 もし、室温が原因であれば、低温でプロテアーゼ処理をしてみる。 低温では効率が下がりますが、その分、時間とお金をかけて（プロテアーゼ増やす）。 その上で"問題無く切断できた安定なサンプル"を再度GSTカラムに流せば、 トラップできるのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2545-3 - 2013/11/13 (水) 16:59:45 - qq thrombinにあまり良い思い出はないです。 切れにくいことに関しては、thrombinの切断部位から少しだけ、離れた制限酵素部位を使ってみるような試みは、ありかもしれない。 入れたタンパクが不溶化することについては、タンパクのの等電点を計算してみて、切断液のpHを等電点よりも少し離すような試みがあっても良いし、CHAPSやスルフォベタインなどのtweiter-ionicな成分を使ってみても良いかもしれない。（濃度等の指摘は私にはできません。）

(無題) 削除/引用 No.2545-2 - 2013/11/13 (水) 16:21:39 - CMV すいません、文頭GFP→GSTの誤りです

トロンビンによるGST切断後に沈殿ができる 削除/引用 No.2545-1 - 2013/11/13 (水) 16:20:04 - CMV 宜しくお願いします。 現在、30kDa程の蛋白にGFPを付け大腸菌に発現させています。 発現させたGST融合蛋白はGEのHiTrapカラムにて精製し 一晩PBSで透析後に、トロンビンをプロトコル通りに添加 室温で転倒撹拌して一晩反応させました。 その結果、白色の沈殿ができ、 上清と沈殿をそれぞれSDS-Pageすると蛋白は殆ど沈殿の方にありました。 また、目分量でGSTは1割程度しか目的蛋白から外れていませんでした。 （トロンビンの量・反応時間を増やしても変わりませんでした） さらにそれを再度カラムで精製を試みると GST単体も切れ残ったGST融合蛋白も殆どカラムに付かず 目的蛋白を精製できませんでした。 （トロンビン処理前のカラム精製でもロスが相当量でました） カラムは新品を使用、各バッファーはプロトコル通りです。 GSTがカラムにトラップされないことについては Ureaでの処理でどうにかできないかと考えていますが、 トロンビン処理で沈殿になってしまうのは防ぐことができるでしょうか? どちらも何かいい案があれば何卒ご指導ください。

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