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(無題) 削除/引用 No.2595-31 - 2013/12/25 (水) 21:26:24 - 名無し 8888888! 上手くいってよかったです。

(無題) 削除/引用 No.2595-30 - 2013/12/25 (水) 14:51:11 - AI うまくいったのなら何をどうしたら上手く行ったのか具体的に書くべきでは？ 他人の意見を聞く割にその対応はよろしくないかと思います

核抽出できました！！ 削除/引用 No.2595-29 - 2013/12/25 (水) 14:35:16 - SORA 皆様、こんにちは。 皆様から助言をいただき、いくつか検討を行った結果、 核抽出することができました。 大きな問題は、抗体でした。 抗体を他のメーカーのものに変えたところ、検出できるようになり、 方法も少し変えて行ったところ、バンドが見えて感動しました。 私の至らない質問にも親身になって助言していただけたおかげだと思っています。 有難うございました

(無題) 削除/引用 No.2595-28 - 2013/12/10 (火) 21:36:43 - SORA mbb様： ありがとうございます。 参考にさせていただきます。 確かに、いつの間にか”見たいタンパクを検出する”から”とにかく核を抽出する”に目的が変わってしまっていたかもしれません。 核が抽出できていないと始まらないですから仕様がないとは思いますが、結果的には目的に沿っていないとだめですよね。

(無題) 削除/引用 No.2595-27 - 2013/12/10 (火) 09:56:48 - mbb 私はこのレシピでうまくいきました。 http://www.lamondlab.com/f7nucleolarprotocol.htm 私とは目的としている実験が違うと思うので、SORAさんの ほしい結果がでるかどうかわかりませんが、ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.2595-26 - 2013/12/09 (月) 23:09:13 - SORA 皆様、いつも未熟な質問に丁寧に答えて下さり有難うございます mon様： 確かに仰る通りで、書籍などを利用して基本から学びなおす必要がありますね。目先のプロトコールにだけ固執していたかもしれません。 > 界面活性剤は0.1%ほどのTriton X100やNP40が汎用されますが、核膜にもダメージを与えます。 > 核膜への影響が少ないdegitonin（高価ですが）を使用する方法も有ります。 大変勉強になります。0.1％TritonはWholecellのWBの時に使用しています。 >溶解後、細胞骨格は核と一緒に沈殿にくる(ことが多い)ので、これをどのように分画するかもいろいろな方法が有り、目的や細胞量によって使い分けます。 やはり場合分けを詳細に学ぶ必要がありますね。ありがとうございます。 おお様 : 至らず申し訳ありません。 bufferA(10mM KCl )で洗わずに、その後の工程を経なければ細胞質sampleを得られないことは理解しました。ありがとうございます。 検鏡については以前ご指導ありました通り、各過程で確認するようにしています。 名無し様 : > ホモジネートとは何か。 愚問でしたね。焦るあまり質問してしまいました。

(無題) 削除/引用 No.2595-25 - 2013/12/08 (日) 08:05:29 - mon 細胞質分画を調製するには、低張液でパンクさせるか、界面活性剤で細胞膜を溶かすか、です。 というか、20年以上前から汎用された技術ですので、もう少し調べた方（本がよいかも）が方が良いですよ。 界面活性剤は0.1%ほどのTriton X100やNP40が汎用されますが、核膜にもダメージを与えます。 そのため、再現性を得るためには、細胞量と溶解液量、撹拌法、保温時間・温度等を一定にする必要があります。核膜への影響が少ないdegitonin（高価ですが）を使用する方法も有ります。 また、溶解後、細胞骨格は核と一緒に沈殿にくる(ことが多い)ので、これをどのように分画するかもいろいろな方法が有り、目的や細胞量によって使い分けます。

(無題) 削除/引用 No.2595-24 - 2013/12/08 (日) 04:25:29 - おお Buffer Aのオリジナルの目的は低調にして細胞を破裂させるということです。なのでA(10mM KCl )で洗えば細胞質のタンパク質は流出してしまいます。そのあと核と細胞質を分離して細胞質の部分をとってきても、細胞質のタンパク質を回収しましたといえないというところが問題になるとおもいます。 さらに疑問はA(150mM NaCl)にしてどれだけうまく細胞が壊せるかです。まあ検鏡などでしっかりとたしかめてOKというならそれはかまいません。もしかしたら一部の核にあるタンパク質は流出するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2595-23 - 2013/12/06 (金) 03:38:32 - 名無し ホモジネートとは何かは、2595-10がすでに説明してくれてる。 読めば、「ホモジネートは何がお薦めか」という問いは、(´･ω･`)??)だわな、と気づいてくれるとおもう。 強い変性剤入りlysis bufferなら物理的にどうこうしなくても普通に溶ける。ただDNAがほどけてネバネバになるが、その場合は超音波でさらさらになるのでその面では有効。

(無題) 削除/引用 No.2595-22 - 2013/12/05 (木) 16:25:45 - SORA おお様 いつも有難うございます。 コメントを見返したのですが、気付けませんでした。すいません。 名無し様 丁寧な回答有難うございます。 大変勉強になります。 質問ですが、 2. Buffer Aのホモジネートから得た沈殿をこのBuffer Bでしずかにしかし十分けんだくする。 ホモジネートは何がお薦めでしょうか 6. 少量の適切なlysis bufferを沈殿に加え蛋白質を抽出する。 この際、懸濁はボルテックス等で行っていますか、シリンジや超音波の方が好ましいでしょうか 私の印象として、かなり強い条件でないと核膜が破れてこないイメージがあるのですが、、、 宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2595-21 - 2013/12/04 (水) 21:31:13 - 名無し 取り敢えず書く。 1. No2595-16の言うBuffer Bに最終濃度0.5%NP40またはTritonX100を加える。(核エンベロープに付着したERなどの膜成分や細胞骨格系蛋白質が除かれこれらの核画分への混入を低減し、核画分の純度を高めることができる。） 2. Buffer Aのホモジネートから得た沈殿をこのBuffer Bでしずかにしかし十分けんだくする。 3. 遠心する。 4. 核画分は沈殿に回収される。 5. 核画分の純度をより高めたいなら沈殿を再度 Buffer Bにけんだくし3~4の操作をもう一度行う。 6. 少量の適切なlysis bufferを沈殿に加え蛋白質を抽出する。使用するlysis bufferの組成により可溶化できるものとそうでないものは変わる。なので以降の実験との兼ね合いや、対象としている蛋白質の抽出の適否から考える。lysis bufferの蛋白質抽出能についてはSDS sample buffer(最強）>高濃度ureaなどの変性剤含むbuffer>>>高張buffer(MgClは入れない、代わりに1mM前後のEDTA入れる）

(無題) 削除/引用 No.2595-20 - 2013/12/04 (水) 10:47:13 - おお もういちどこめんとよんでくれない?

(無題) 削除/引用 No.2595-19 - 2013/12/02 (月) 10:26:38 - SORA mon様、おお様 ご指摘ありがとうございます。 ご指摘の部分変更してプロトコール作成しました。 BufferBの組成は特に問題ないでしょうか？ また、個人的感覚としては細胞膜よりも核膜の方が堅いイメージがあるのですが、ピペッティングのみの懸濁でよいのでしょうか？ 宜しくお願い致します。 ・Buffer A 10mM HEPES（pH7.9）　 150mM NaCl 1.5mM MgCl2 0.5mM PMSF +1mM DTT ・Buffer B 20mM HEPES（pH7.9） 420mM NaCl 1.5mM MgCl2 +1mM DTT 方法： ・DPBSで洗う ・DPBS1mLを加え、セルスクレーパーで掻き取り ・2000rpm、4℃、5min遠心・上清破棄 ・氷冷されたBufferAを500µL加えて氷上にて15minインキュベーション ・シリンジにて破砕 ・14000rpm、4℃、10min遠心 ・上清を別のエッペンに移す→Cytosol-fraction ・BufferB50µLをペレットに加え、ピペッティングにて泡が出ないように再懸濁 ・4℃（冷蔵庫）にて15minインキュベーション ・14000rpm、4℃、15min遠心 ・上清→Nuclear-fraction

(無題) 削除/引用 No.2595-18 - 2013/11/30 (土) 17:29:55 - おお 超音波で核がばらけてしまっているってことはないでしょうかねぇ。。。NP-40つかうなら超音波しなくてもいいんじゃないかとおもいますが。 NP-40を使わずにニードルで細胞膜を壊すというのもよくやられています。 指摘があるようにbuffer Aでさいしょに洗っているのはよぶんです。あらわずにAをいれて、NP-40で処理するとかニードルでしょりすればいかとおもいますが。核だけがきょうみあるのであればあらってもいいんだけど、buffer Aだけでも細胞破裂する(全部でなくても一部はその段階でしている)のでcytosol fractionをそのステップですてていることになります(すでにしてきがありますね)。

(無題) 削除/引用 No.2595-17 - 2013/11/30 (土) 11:32:06 - mon bufferAは低張液なので、細胞はパンクして細胞質画分は上清に来ます（この場合、捨てている） 10mM KClを150mM NaClに置換すべきでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2595-16 - 2013/11/29 (金) 21:37:16 - SORA おお様 相性が悪いのは知りませんでした 現在使用しているプロトコールです ・Buffer A 10mM HEPES（pH7.9）　 10mM KCl 1.5mM MgCl2 0.5mM PMSF +1mM DTT ・Buffer B 20mM HEPES（pH7.9） 420mM NaCl 1.5mM MgCl2 +1mM DTT ＊BufferAorBにEDTAを加えるときもある 方法： ・DPBSで洗う ・氷冷されたBufferAを1mL加えて、セルスクレーパーで掻き取り ・2000rpm、4℃、5min遠心 ・上製を捨てBufferA1mLで再度洗う ・2000rpm、4℃、5min遠心 ・上清破棄し、BufferA+0.1％NP-40を500µL加え、氷上にて5minインキュベーション ・超音波にて破砕 ・14000rpm、4℃、10min遠心 ・上清を別のエッペンに移す→Cytosol-fraction ・BufferB500µLをペレットに加え、ピペッティングにて泡が出ないように再懸濁 ・4℃（冷蔵庫）にて15minインキュベーション ・14000rpm、4℃、15min遠心 ・上清→Nuclear-fraction

(無題) 削除/引用 No.2595-15 - 2013/11/29 (金) 00:54:47 - おお 300mMNaClぐらいではヒストンン(クロマチン)を壊さずに比較的そのほかの蛋白を溶出できますのでそう言うプロとコールはあります。かわりにKClを使うこともあるとおもいます。ただしK+はSDSと相性がわるい。

(無題) 削除/引用 No.2595-14 - 2013/11/28 (木) 22:28:35 - SORA おお様 今現在検討しているプロトコールにおいては、超音波での破砕と記載されているので、このままそこは変更しないでまず超音波で検討を続けてみます。 qq様 現在はNaClを含んでいないBufferにて検討を行っていますが、2、3回前のプロトコールでは300〜500mMのNaClを含むbufferにて検討を行っていました。 Wholecellでの抗体の検討を終えたら、プロトコールを含めNaClの検討も行ってみます！！ ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2595-13 - 2013/11/28 (木) 20:56:26 - qq 核タンパク質は、塩で抽出する場合があります。0.5-1M 程度のNaCLや硫安などです。ヒストンを抽出する条件だと思いますが、詳細はご自身でお調べください。

(無題) 削除/引用 No.2595-12 - 2013/11/28 (木) 15:08:04 - おお 何ともいえませんが、同じバッファーでなら、ニードルで抽出効率が悪い蛋白であれば、超音波の方が抽出効率がいいかもしれません。

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