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(無題) 削除/引用 No.2654-9 - 2013/12/16 (月) 16:38:35 - ぴよぴよ 皆様がすでに書かれていますが、タンパク質の発現を抗体で見る場合、 WB<<ICC<<IHC の順に難易度が格段に増していきます。 つまりWBで使えてもICCで使えないのも、ICCで使えてもIHC では使えないことも非常によくあることです。 発現量や発現組織によって使えないこともあります。 残念ながら、企業が販売している抗体でもよくあるので、 少量ずつ購入するか、サンプルを貰って自分の実験系で 使えるか試すのが普通です。 どこまでの労力をかけられるのかは実験により異なりますが、 ICCでバッチリと見えないのであれば、当然IHCでは全く見えないでしょう。 少なくとも標的組織の培養細胞か、transfectionした哺乳細胞のICCの 結果を指標に抗体を幾通りも作製し検討するのが早道だと思われます。 仮に抗体はそのままで固定法や染色法、賦活化法を検討される場合には、 組み合わせは非常に多く、それを組織切片で検討される場合には 半年は覚悟された方が良いです。 それは抗原と抗体の組み合わせに応じて、ベストな条件が異なり 人の意見があまり役に立たないからです。 だからこそ、一度確立された染色条件は貴重な知識なわけですが。 �@PFAかザンボニ液か �A後固定の有無と時間 �B切片の厚み �C抗原賦活化処理（プロK処理、トリプシン処理、電子レンジ、オートクレーブ、賦活化液の種類とpH、温度条件、反応時間） �Dブロッキング濃度・時間、界面活性剤の種類 �E1次抗体の濃度・温度・時間 �Fフロートで染めるか、貼り付けで染めるか �GABC法、DAB、ポリマー法、TSA法 これら全ての条件をシラミ潰しにする時間と労力と金銭を掛ける価値が あるかは、よくよく考えられたほうがいいです。 �Gの発色の工程で必要な抗体やキットは結構高額です。 条件検討はパラメーターが少ない方が楽ですから、 基本的にICCでバッチリ使える抗体が出来るまで頑張るという方針が 私のお勧めです。

(無題) 削除/引用 No.2654-8 - 2013/12/13 (金) 15:48:15 - AA 標的組織の初代培養で一応は検出できているとのことですが、 染色のパターン、細胞内局在は予測しているとおりでしょうか？ 微弱なシグナルであるとノイズである可能性もありますし、 それを本物だと思い込むと痛い目を見ることになります。 それと、ICCとIHCでは同じ抗体で染色したとしてもICCとのほうが染色性が良いです。

(無題) 削除/引用 No.2654-7 - 2013/12/13 (金) 12:51:45 - qq 組織さま、有難うございます。

(無題) 削除/引用 No.2654-6 - 2013/12/13 (金) 12:48:21 - 組織 >[Re:5] qqさんは書きました : > ピクリン酸で固定して、抗原性が維持できるとはとても思えないのですが、コノ固定液でうまく免疫染色できる例をもってらっしゃるのでしょうか。 ザンボニ液は免疫染色でよく用いられる固定液です。抗原にもよりますが、ホルマリンよりも良好な成績を得られることが多いです。

(無題) 削除/引用 No.2654-5 - 2013/12/13 (金) 11:06:19 - qq ＞組織化学染色はザンボニ液で還流固定し、 を、知らないのですが、ピクリン酸の入った固定液ですね。 ピクリン酸で固定して、抗原性が維持できるとはとても思えないのですが、コノ固定液でうまく免疫染色できる例をもってらっしゃるのでしょうか。 パラホルで還流固定をしてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2654-4 - 2013/12/13 (金) 08:34:03 - 組織 免疫組織化学で一番重要なのは固定法です。もし新しく材料が採取可能なら、新鮮凍結（未固定）切片を作製して、色々な固定法を試してみてはいかがでしょうか？ザンボニ以外にも、ホルマリン（PFA）、PLP、アセトン、メタカンなどがあります。 凍結切片では、抗原賦活は基本的に必要ないと思ってます。ただ一部の核内抗原などには加熱処理が有効なこともあるようです。 ちなみにWBで使えてIHCで使えない抗体はままあります。

(無題) 削除/引用 No.2654-3 - 2013/12/13 (金) 01:45:36 - おお 組織から直接蛋白をとってWBで見れますか? ノンすぺがでない程度(出る直前まで)抗体の濃度をあげるとか手はないことはないですが。

(無題) 削除/引用 No.2654-2 - 2013/12/13 (金) 01:25:24 - 独り言 ウエスタンブロットの結果と免疫染色の結果は、比較に値しません。ウエスタンブロットなんてSDSでガチガチに一本にほどいているので、全く条件が違います。賦活化は是非行ってみるべきですが、ウエスタンに使えるからといって、期待しない方が良いです。賦活化方法は全部試してみましょう。 培養細胞のタンパク質過剰発現で見えても、内在性がしっかりと見えない限りは、組織で免疫染色は難しいでしょう。特に組織は固定方法がより強力なので、組織染色だとできない場合が多いです。その場合は、PFA固定のクライオ切片にすれば、染色できる可能性は高いです。 とりあえず、培養細胞でしっかりと内在性のタンパク質が見える条件（固定、ブロッキング、抗体濃度など）を決めた方が良いです。 ちなみに ”免疫染色はわずかな細胞だけシグナルが確認でき”ってどういう事ですか？培養細胞なのに、発現している細胞と発現していない細胞があると読み取れますが、そういうランダムな発現でよいタンパク質なのでしょうか。

免疫染色トラブル(細胞〇、組織×) 削除/引用 No.2654-1 - 2013/12/13 (金) 00:43:44 - アンステイン 初めての投稿となります。 よろしくお願いします。 �@私はウサギに標的タンパク質のエピトープに相当する合成ペプチドを免疫して抗血清を取得し、同じ合成ペプチドを用いてカラムを作成して、アフィニティ精製しました。 これを1次抗体として現在実験を進めています。 �A抗体の特異性の検定として、哺乳類培養細胞に目的タンパク質の発現ベクターをトランスフェクションして、それを免疫細胞染色とウェスタンブロットを行い、免疫反応が確認できました。 �B次に標的組織の培養細胞の免疫染色と標的組織のライゼートのウェスタンブロットを行いました。 結果、免疫染色はわずかな細胞だけシグナルが確認でき、ウェスタンブロットでは目的の分子量にバンドが確認できました。 �Cそして、免疫「組織」染色ではまったくシグナルが見られませんでした。 組織化学染色はザンボニ液で還流固定し、後固定、スクロース置換、凍結包埋、切片とし、賦活化は特に行っていません。 ISHのデータベースで集めた情報や、ウェスタンブロットのバンドの強さを見るに単純な発現量が少ないわけではないと思うのですが・・・ 抗原エピトープが立体構造で隠されているという可能性を考えたのですが、その場合は�Aの細胞化学染色ではなぜ強いシグナルが見られたのかという疑問があります。 過剰発現による影響なのでしょうか？ また、その場合は賦活化処理が必要だと思うのですが、賦活化を行ったことがないので方法の選択等でポイントがありましたらお教えください。

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