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Re: 削除/引用 No.2656-17 - 2013/12/19 (木) 17:16:29 - UC ご報告です。 ソニケーションしなしの熱変性でどれくらい1本鎖のDNAが増えるかをチェックしました。結果、%ssDNAは、これまでのをまとめて書くと、 前: 26.5% (未処理の精製ゲノム） 後: 55.9% (150bpへのsonication＋熱変性なし) 後: 96.1% (150bpへのsonication＋熱変性あり) 後: 91.0% (sonicationなしで熱変性のみ) となりました。単なる熱変性後の急冷でも9割以上は1本鎖になり、これならあえてソニケーションをしなくても良さそうです。今回は、急冷後、すぐに測定しましたが、時間を置くと４℃でも徐々に２本鎖の割合が増えていったりするのかな。

Re: 削除/引用 No.2656-16 - 2013/12/18 (水) 17:08:24 - UC paさん、中年さん、APさん、おおさん、コメントありがとうございます。参考になります。 >UCさんの示された数値は、熱変性への断片化の影響を調べられたというこ >とで、明示されてませんが熱変性も行われてると解釈していました。ソニ >ケーションの効果に対する言及も同様に熱変性を前提に言われてるのだろ >うと思います。 に関してですが、先に挙げたものは熱変性をする前の数値です。単なるソニケーションでどれくらい1本鎖が増えるのかに興味がありましたし、それに加えて熱変性したらどうなるかも、もちろん興味があるというか、実験上、その過程も入りますので、今日、昨日ソニケーションで断片化したものを熱変性(95℃, 5分→氷水)して、同様に測定してみました。結果、%ssDNAの値は(前回の結果も含めて書くと)、 前: 26.5% 後: 55.9% (熱変性なし) 後: 96.1% (熱変性あり) となりました。まさか9割を超えるとは思っていなかったので、ちょっと驚きました。これなら、実験に問題なく使えそうです。 >ソニケーションで一本鎖DNAが増えるとは不思議です。二本鎖が互い違いに >切れて断端に一本鎖部分が露出しているだけかもしれません。 これはそうなのかなと思います。当初は、超音波で2本鎖がスパッと切れるようなイメージを持っていましたが、実際は、2本鎖の内、1本鎖だけが切れるものがあり、今回のように150bpの小さいサイズだと、断端の1本鎖も千切れ、1本鎖が増える、ということかなと思います。 これに熱変性を加えると、解離した1本鎖は、皆さんのご指摘のように、もはや 相補鎖を探せずに、大部分は1本鎖のままであると。 機会があれば、ソニケーションなしの熱変性のみで%ssDNAがどれくらいか調べて報告しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2656-15 - 2013/12/17 (火) 21:57:55 - AP 古典的な方法としてはハイドロキシアパタイトカラムによるssDNAとdsDNAの分離があります（たしかMoleular Cloningのappendixにも載っている）。 たしかQiatipのようなイオン交換樹脂でも溶出条件でssとdsを分離できたかと。 EtBr存在下でCsCl超遠心しても分離できるかも。

(無題) 削除/引用 No.2656-14 - 2013/12/17 (火) 20:45:48 - おお PMID: 16303234 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201001332/abstract Graphene oxideがssDNAに特異的につくようですが、、、あふぃにティーがつよいなら、、、 ssDNA/RNAに特異的につくような傾向色素などであれば過剰に入れるとアニーリングがそがいされるとかないかなぁと漠然と思ったり、、、

(無題) 削除/引用 No.2656-13 - 2013/12/17 (火) 18:47:20 - pa 中年さん、APさんのコメントは全くおっしゃるとおりだと思います。 UCさんの示された数値は、熱変性への断片化の影響を調べられたということで、明示されてませんが熱変性も行われてると解釈していました。ソニケーションの効果に対する言及も同様に熱変性を前提に言われてるのだろうと思います。

(無題) 削除/引用 No.2656-12 - 2013/12/17 (火) 18:33:07 - AP >NaOHなどの強アルカリ変性では、鎖間の水素結合が切れて不可逆的に1本鎖になるらしいのですが、その結果をゲルで見た限り、それほど効率が良いとは思いませんでした(短めの2本鎖オリゴで検証)。 他の方も指摘されていますが、鎖長が短いほどハイブリ速度は早い、複雑さの低い配列で濃度が高い（単一の二本鎖オリゴDNAのみからなる系のように）のハイブリ速度は早い、のですからその判断はフェアじゃないんじゃないかと思いました。 断片化していないゲノムDNAを「完全に」解離するのはむずかしそうな。同一のDNA鎖上でも一部が解離したとき他の部分は解離していない、次の瞬間、解離していたところが再会合して、別のところが解離する、というような熱運動？　平衡状態？　になり二本の鎖が自由に離れ離れになりにくいと思われるからです。 むかしむかし、ccc plasmidを鋳型にklenowでサンガー法シークエンスをするときは、プラスミドをNaOHと温和な加温で解離して（cccは熱処理だけでは解離しにくい）EtOH ppt、再溶解時にプライマーも加えて即反応、ということをしたものさ。 実験の目的がよく分からないので可能かどうかわからないけれど、解離と同時にあるていど塩基を修飾して水素結合をブロックするというのはどうか（フォルムアルデヒドとかで）。

(無題) 削除/引用 No.2656-11 - 2013/12/17 (火) 17:40:42 - 中年 実際に一本鎖の割合が増えているというデータを前にして理屈を捏ねても仕方がないのかもしれませんが、ソニケーションで一本鎖DNAが増えるとは不思議です。二本鎖が互い違いに切れて断端に一本鎖部分が露出しているだけかもしれません。 熱やアルカリ処理で二本鎖DNAはほとんどが一本鎖になりますが、オリゴヌクレオチドのように均一な配列ばかりだと、変性条件が緩和されればアニーリングするのは仕方がないことだと思います。不可逆はどうかは変性方法の問題ではなく、その後にアニーリングし得る条件にどのくらい置いたかによるでしょう。 一方、たまさんがお書きになっているように、ゲノムDNAのようなcomplexityの高い材料の場合には、アニーリング時に正しい二本鎖の相手を見つけるには膨大な時間が掛かるでしょう。その意味では、事実上不可逆と言って良いように思います。ただし、繰り返し配列などは早くアニーリングするでしょうし、条件によっては局所的な相同性を利用して二本鎖になる画分もあるでしょう。 Cot解析の解説などが参考になるかもしれません。 http://en.wikipedia.org/wiki/Cot_analysis

(無題) 削除/引用 No.2656-10 - 2013/12/17 (火) 17:15:23 - pa UCさんの数値参考になります。 duplex-specific nucleaseで処理するのも一本鎖の割合を上げる良いオプションだと思います。

Re: 削除/引用 No.2656-9 - 2013/12/17 (火) 16:19:04 - UC 自己レスになりますが。 とある細胞株由来の精製ゲノムをNanoDrop(以下 N)とPicogreen(以下 P)で濃度 測定し、1本鎖のDNAの割合を簡易的に、 　%ssDNA = (N - P)/N で定義して、Covaris M220でゲノムを150bpに断片化、前後で%ssDNAの値を比較 してみました。結果は、 　前: 26.5% 　後: 55.9% となり、150bpに断片化すると、ssDNAの割合が2倍ぐらいになりました。全体に 占める割合は、5割強という感じです。大半を1本鎖にとはいきませんが、まぁ 5割を超えるぐらいには、1本鎖の割合が増えるんですね。ご報告まで。

Re: 削除/引用 No.2656-8 - 2013/12/13 (金) 12:49:16 - UC てすさん 文献ありがとうございます。formamideと低濃度のNaOHの組み合わせは検討してみる価値はありそうです。

Re: 削除/引用 No.2656-7 - 2013/12/13 (金) 12:40:19 - UC nさん ＞検出はdsもssも同様に出来るものなのですか？ GelRedで染色すれば、1本鎖も十分に染色できます。 ＞single-strand DNA binding protein (SSB)加える？ ＞片方の鎖だけPCRで増やす？ に関しては、なるべくbiasがかからず手間もかからない手法が あればと思いました（増幅だとゲノムのメチル基などの情報も 失われてしまいます）。

(無題) 削除/引用 No.2656-6 - 2013/12/13 (金) 12:38:19 - てす PMID: 9497922

Re: 削除/引用 No.2656-5 - 2013/12/13 (金) 12:35:47 - UC たまさん 断片化したサイズによっては、そうなるかもと期待しているところです。いくつかサイズを振ってみて、NanodropとPicogreenなどを組み合わせて、簡易的に1本鎖と2本鎖の比でも出せば良いかなとは思っています。 nさん >ゲル中でアニーリングしてる？？ これは思いました。結構、泳動bufferが熱くなっていたので。これもエタ沈精製後に、上記のように評価すれば良いのかな。

(無題) 削除/引用 No.2656-4 - 2013/12/13 (金) 12:34:44 - n 全然知らないんですけど、すいません。 >その結果をゲルで見た限り、 ゲル中でアニーリングしてる？？検出はdsもssも同様に出来るものなのですか？ 思いついたことだけ書きますが、多分ダメだろうなぁ。 single-strand DNA binding protein (SSB)加える？ 片方の鎖だけPCRで増やす？ ゲルろ過などで分離してしまう？

(無題) 削除/引用 No.2656-2 - 2013/12/13 (金) 11:48:05 - たま 私は逆に、断片化したゲノムを熱変性したら、そうそう相補鎖には巡り会えずにほとんどが変性状態のままなのではないかと考えて今困っているところなのですが、私の認識は間違っているでしょうか。。

2本鎖DNAを不可逆的に1本鎖にする方法 削除/引用 No.2656-1 - 2013/12/13 (金) 09:52:01 - UC お世話になります。 タイトル通りですが、効率よく相補的な2本鎖DNAを1本鎖に出来る手法を 探しています。一般的には、熱変性で1本鎖になりますが、これは可逆的な ものです。NaOHなどの強アルカリ変性では、鎖間の水素結合が切れて不可 逆的に1本鎖になるらしいのですが、その結果をゲルで見た限り、それほど 効率が良いとは思いませんでした(短めの2本鎖オリゴで検証)。ホルムアミド はアルカリ変性よりもさらに効率が悪かったです。 ゲノムDNAだと、ソニケーションで数百ベースに切断すれば、ある程度は、 1本鎖になるようですが、2本鎖の方が多いのではと思います。 知りたいことは、1本鎖への変性処理をして、エタ沈などで精製した後に 果たして、安定的に1本鎖が大半を占めるようなプロトコルがあるのか どうかです。ゲノムDNAでそういうのがあればベストですが、数十merの オリゴベースの2本鎖でも良いです。 ソニケーションでいえば、100-200bpのような十分小さいサイズまでに切断 すれば、それなりに1本鎖が優勢になったりするのだろうかと思いますが、 いかがでしょうか。

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