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(無題) 削除/引用 No.2662-27 - 2013/12/22 (日) 02:35:50 - おお ECLキットがふるすぎますねぇ。primeはメーカーは3ヶ月ぐらいといっているようです。ECLのキットはたいてい確実に古くなるとシグナルが出なくなっていきます。一つの理由はH2O2かそれに変わる酸化剤が使われているからです。だめになったやつにH2O2を加えると復活する場合もありますが、キットによってはバックが出過ぎたり、持続力がなかったりもしますので、、、とりあえずは新しいの買ってもらうか、単発なら隣のラボとかに一回分だけということで使わしてもらうか。2次抗体も悪くなりますが、これは保存の状態によって寿命が大きく変わってくると思いますので。。。

(無題) 削除/引用 No.2662-26 - 2013/12/21 (土) 23:04:39 - 名無し 5年前に買ったECLでは残念ですがもう役割を終えていると思います。いくら過酸化水素が例外的に安定なROSとはいえ、希薄溶液中で５年は無理のように思います。１年後でも反応性の低下を感じますから。シグナルがでないのはそのせいではないでしょうか。使用期限が明記されているはずなので、先生に示して再購入をもとめるべきとおもいます。どうしても買わないというなら、いまはよく新発売のECL試薬の少量試供品とかときどき見かけるので、ネット検索or業者の人に頼んで探してもらいそういうものを入手できるかもしれません。ECLは自作も可能です。 抗体については数ヶ月で目に見えて反応性が悪くなるものから、5~6年４C保存してても余裕で使えているものまで実際にあるのでなんともいえません。ただHRP標識2次抗体は抗体よりも酵素の方が失活してしまうことがあるので、古いのはさけるのが賢明とおもいます。いずれにせよ不安材料のある試薬類は極力避けるべきでしょう。 ポンソーはメンブレンにはよく使いますがアクリルアミドゲルの染色には不向きです。いずれにせよCBBと比べ検出感度は明らかに落ちます。CBB R250は蛋白質の実験している部屋なら普通にあると思いますし、あるいはそれに相当するゲル染色液を購入しているとおもいます。BCA試薬キット（あるいは他の蛋白質定量試薬キット）も同様です。他の研究室の協力を得ることで、本来しなくていいはずの苦労をすこしでも回避できるのではないでしょうか。書かれた内容から察するに、もし生命科学に関連した施設ならば所属機関内にはこの分野の実験、研究に精通した方がかならずいると思いますから（別に教員や独立した研究者でなくてもいいです。学生でも構いません。）そういう方を見つけて相談しながら段階を踏んで研究をすすめられるのがよいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2662-25 - 2013/12/21 (土) 22:01:57 - TS ２次抗体100倍で、ecl primeだったら、真っ黒では？

(無題) 削除/引用 No.2662-24 - 2013/12/21 (土) 22:00:40 - TS アクチンくらいでそうな雰囲気だけど。 本当に出ないならやり直しでしょうが。 白抜けじゃないですよね。 ２次抗体はどんなに濃くても10000倍以上が一般的です。

(無題) 削除/引用 No.2662-23 - 2013/12/19 (木) 19:41:07 - ウェスタン初心者 すみません、アクチン抗体のところ抜けてました。 アクチン抗体(sigma, A2103)です。8000倍希釈で使い、 二次抗体は免疫染色で使っているVectorのHRP標識の抗体を100倍希釈でやりました。

(無題) 削除/引用 No.2662-22 - 2013/12/19 (木) 19:20:29 - ウェスタン初心者 Pr　様 ご意見ありがとうございます。 端のレーンが追い出される減少はタンパク量が多いとなるのですね。 たしかに、マーカーは1レーンあたり2ulずつしかいれなかったため、 濃度差はかなりあったのかもしれません。 DNAについては自分でも不安に思っていました。 超音波の機械がないのですが、DNaseなどで分解させたりしたほうが良いのでしょうか？ TS様 ご意見ありがとうございます。 逆にタンパク質量を増やすという手もあるのですね。 確かに、昨日〜本日でβアクチンを含めて抗体反応をしてみたのですが、 何もバンドが出ませんでした。 (抗体反応は4度一晩、二次抗体は室温30分、検出はECL primeでやりました) どうやら以前にウェスタンをした先輩がいたようで、 アクチン抗体(Sigma A2)とECLは2008年に購入・開封した記録があるものを使いました。 もう一度タンパク量を増やして、やり直してみようかと思います。 qq様 ご意見ありがとうございます。 仰るとおり、キットから始めようというのは虫のいい話でした。 ただ、今調べてみたのですが、ビシンコニン酸ナトリウムは2gで2万円くらいしてしまいます。 (業者の方に教えていただいた和光純薬の試薬検索ページで調べています) BCAキット自体は1万5千円くらいのものからあり、 やはりキットで買うほうが先生の了解を得やすそうだと思っています。 もちろん自分の勉強にはよくないので、しっかり理解してやろうと思います。

(無題) 削除/引用 No.2662-21 - 2013/12/19 (木) 17:15:41 - qq ＞BCAキットを買ってもらえなかったため、定量ができませんでした。 BCAキットではなく、BCAと硫酸銅その他であれば、買ってもらえるんじゃない？？ NP40だけの問題であるなら、＋SDSでローリー法でタンパク定量できるよね。 必要な試薬は自分で探しなさいね。ローリー法のキットはきっと買ってもらえないでしょうから、同じことです。キットを即座に買わない所なんか、かなり良い先生だなぁ（いや、本心で）。

(無題) 削除/引用 No.2662-20 - 2013/12/19 (木) 16:56:25 - TS ＞開始重量を揃えて大体1ug/ulくらいになるだろうという量のバッファーを使い、1レーンあたり(計算上)だいたい10ugになるようにボリュームを揃えてアプライしました。 Prさんがおっしゃるように、WBできれいに検出するためには、S/N比を高めるためにももっと少なくという手もあると思いますが、実際的に30μｇくらいまでは泳動や検出に大きな影響は出ないと思うんですが、でますかね。うちでは50μgくらい仮に載せても特に問題にはなりません。 また確かにポンソーでうっすら染まる程度、というのは10μｇ程度の気がします。 でも仮にタンパク量がそれなりのところにあるとしても、定量するつもりで、タンパク量も測定していないサンプルを流すというのは、私の感覚ではありえないです。そのくらい買ってくれない教員って。。。ナカライとかキャンペーン中ですよ!って教えてあげたら?（笑 でも転写まではなんとなくうまく行ってるんじゃないでしょうか。 βアクチンとかも含めて検出してみては?　 聞いた感じだと、とりあえず検出まではうまく行ける流れに乗っているような気がしました。がんばってください。

(無題) 削除/引用 No.2662-19 - 2013/12/19 (木) 15:44:36 - Pr マーカーは問題なく流れていて、端のマーカーが横に追いやられて、ということはサンプルが濃すぎるのでしょうね。 あとは、DNAが大量に混じってたりしてないですかね。 サンプル調製の際に、ゲノムDNAをよく切断してますか？ いずれにしても、もっとサンプルもっと薄めてよいと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2662-18 - 2013/12/19 (木) 15:14:24 - ウェスタン初心者 転写はタンク式です。30V定電圧で一晩(夜10時〜朝12時)転写しました。 バッファーは、Tris 30.3g、Glycine 144.1gを水に溶かして 800mlにメスアップしたものを10x stockとし、 最終的には20%メタノールになるように水とメタノールで希釈しました。 タンパク質の量は実は不明です。 先行論文からNP-40の入ったバッファーで可溶化したのですが、 BCAキットを買ってもらえなかったため、定量ができませんでした。 一応ここで教えていただいた、総重量の約10%がタンパク質である、というのを参考に、 開始重量を揃えて大体1ug/ulくらいになるだろうという量のバッファーを使い、 1レーンあたり(計算上)だいたい10ugになるようにボリュームを揃えてアプライしました。 マーカーは泳動中もうっすらくらいにしか見えなかったので、 ご指摘の通り、見づらいのは色調のせいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2662-17 - 2013/12/19 (木) 14:06:50 - TS ＞ゲルには分子量の大きいもの(分離ゲル開始地点から1cmくらいまで)のものが、赤いバンドのように染まり、転写されずに残っているように見えました。 転写はタンク式ですか、セミドライですか?　タンク式の方が高分子領域の転写領域が明らかに良いですが、自作の15％のゲルだといずれにしても100〜150kDaくらいから上はゲルに残るでしょう。目的タンパク質付近がきれいに転写されていれば問題ありません。 ＞一方でメンブレンにはマーカーの色のついたバンドがもともと見えており、 ポンソーで染めてみるとうっすらとバンドが見えました。 バンドの形はCBBの流れ具合から乱れているかと思いましたが、かなりまっすぐでした。 何マイクログラムのタンパク量をのロードしましたか？　20μｇ以上であれば、それなりにくっきりと見えると思います。ポンソーで染める前には、メンブレンをよく水洗しましたか。もし転写バッファーにSDSなどが入っているとかなり染まりが悪くなると思います。 ＞ただ、今回見たかったタンパク質とβアクチンとの大きさの都合から15%で 分離ゲルを用意し(アブカムのプロトコルに15-45kDa＝15%とあったため)、 100V定電圧で流したのですが非常にゆっくり進み、 結局3時間位流したのですが、ポンソーで見えたバンドは 分離ゲル開始点から4cmくらいのところまでしか進んでいませんでした。 分離ゲルの大きさは大体高さ10cmです。 どうでしょう。もう少し先まで進んでて良さそうですが、100Vで３時間ですか。ミニゲルだと120Vで1.5時間くらいなので、そんなものかもしれませんね。どこまで進んだか、バンドが見えるべきかは、マーカーの移動度を見たらおかしいかどうかわかると思います。15％だと、10kDaくらいのマーカーがゲルの先端近くまで進むくらいが良さそうですが。もう少し高い電圧が一般的かと思います。たぶん120〜200V。 ＞また、マーカーも3色のマーカーで、35、90、140kDaのところに赤や黄色の バンドが出るはずなのに、それ以外の青のバンドしか見えません。 青以外の色というのは一般的に転写されにくい、などといいうこともあるのでしょうか？ 転写前のゲルにはすべてがきれいに見えたのですよね。そうすると、色に限らず、転写条件とマーカー次第じゃないかと私は思います。安いマーカーを探していくつかを試したことがありますが、転写条件によっては色が見えにくいもの（抜けてる?）のがありました。ただそれでも色調上、黄色はやや見えにくいでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2662-16 - 2013/12/19 (木) 13:51:58 - ウェスタン初心者 すみません、一つ下の投稿にお礼が抜けてしまいました。 色々と指摘やアドバイスをありがとうございます。 皆様にいろいろ教えていただけて非常に心強いです。

(無題) 削除/引用 No.2662-15 - 2013/12/19 (木) 13:50:27 - ウェスタン初心者 TS様 クマシーブリリアントブルーは色素が試薬棚に見つからなかったのでできなかったのですが、 ポンソーはなぜかあったのでゲルとメンブレンを染めて見ました。 (組成は、10x stock=2%ポンソーS/30%トリクロロ酢酸/30%スルホサリチル酸/ddH2O、としました) ゲルには分子量の大きいもの(分離ゲル開始地点から1cmくらいまで)のものが、 赤いバンドのように染まり、転写されずに残っているように見えました。 一方でメンブレンにはマーカーの色のついたバンドがもともと見えており、 ポンソーで染めてみるとうっすらとバンドが見えました。 バンドの形はCBBの流れ具合から乱れているかと思いましたが、かなりまっすぐでした。 ただ、今回見たかったタンパク質とβアクチンとの大きさの都合から15%で 分離ゲルを用意し(アブカムのプロトコルに15-45kDa＝15%とあったため)、 100V定電圧で流したのですが非常にゆっくり進み、 結局3時間位流したのですが、ポンソーで見えたバンドは 分離ゲル開始点から4cmくらいのところまでしか進んでいませんでした。 分離ゲルの大きさは大体高さ10cmです。 このくらいの泳動度と言うのは普通なのでしょうか？ 変な流れ方していたBPBですが,一番前の先は一番下まで来ていました。 また、マーカーも3色のマーカーで、35、90、140kDaのところに赤や黄色の バンドが出るはずなのに、それ以外の青のバンドしか見えません。 青以外の色というのは一般的に転写されにくい、などといいうこともあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2662-14 - 2013/12/18 (水) 10:46:47 - TS WBはステップが多いと感じると思いますが、 特に最初のころは、各ステップがうまくできたかどうかを確認するのが良いと思います。 問題を切り分けることができ、トラブルシュートしやすいです。 まずSDS-Pageがうまくできたかどうかは、ゲルをCBB染色すればよいでしょう。 その後の転写がうまくできたかどうかは、PVDFをポンソー染色できます。 CBB染色はしてしまうと、そのゲルは使えなくなりますが、マーカーだけを見ていたり、BPBだけをみてもうまく流れたかどうかは確かにはわかりませんので。 ポンソーは脱色して（しなくても）、抗体反応に進めることができるので、わたしは毎回やります。 電気泳動がうまく行ったこと、転写がきれいにされたことが確認できます。 WBを手探りでやれと言われたら大変だと思いますが、頑張ってください。

(無題) 削除/引用 No.2662-13 - 2013/12/18 (水) 10:32:37 - ウェスタン初心者 皆様 ご意見ご指摘ありがとうございます。 バッファーのpHで変わることもあるのですね。 一応8.8と6.8の取り違えなどは無いかと思いますが もう一度確認してみます。 BPBの広がり方なのですが、 濃縮ゲルと分離ゲルの境目まではほぼ一本線になる感じで 流れていたのですが、分離ゲルに入ったら横方向だけではなく 縦方向にも広がり始め、中盤以降では1つのウェルの中でも 右と左で広がり方が違って、下から上へ巻き上げたような 入道雲みたいな形になってしまっているものもありました。 マーカーは端っこのレーンは斜めに流れてしまったのですが、 真ん中のウェルに入れたものは、一応色のついたバンドが 分離して見えていました。 泳動の写真をとっておけばよかったのですが、 教科書を見ながらやっていて思いつきませんでした。 次回も同じ状態になったら撮りたいと思います

(無題) 削除/引用 No.2662-12 - 2013/12/18 (水) 02:31:45 - おお BPBは絵がないので正直よくわからないのですが、皆さんの想像と、質問者の見ているものが一致しているかどうかもよくわからないですね。前後にはブロードになりにくいですが若干の拡散によりシャープさは失われることはあるとおもいます。マーカーがまず正常に流れているかがゲルのこんでぃしょんのめやすになると思いますがどうでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.2662-11 - 2013/12/17 (火) 21:55:43 - 名無し 書かれているBPBの様子は普通とちがうので、濃縮効果が上手く言ってないようですね。gel bufferのpHか、泳動bufferの塩濃度とかpHがかなりズレてるのかもしれないですね。分離ゲルbuffer ~pH6.8と濃縮ゲル buffer ~pH8.8、と組成は再度確認した方がいいですね。泳動bufferは、指定の量のGlycineとTrisとSDSを混ぜるだけでpHを合わせる必要はないのですが、どうでしょうか。ストックで保存して使用時に希釈する場合もしばしばありますが、10倍濃度溶液と１倍濃度溶液を取り違えたりとかしていませんか。落ち着いて確認してみてください。 アクリルアミド濃度が16%とか17%とかの濃度のかなり高いゲル（低分子量の蛋白質の分析目的で使用する事が多い）だと、特に問題なくてもBPBが分離ゲルに入ってからややブロード気味になってくることはたしかにあります。ゲル濃度がかなり高いとかいったことはありませんか。

(無題) 削除/引用 No.2662-10 - 2013/12/17 (火) 21:11:06 - おお 濃縮ゲルは好みもあるかもしれませんが、10cm程度のミニgelであれば1cm程度で十分でしょう。わたしはどうも思った高さより余分にぶんリゲルを入れてしまう癖があり、5mmぐらいになってしまうことがありますが、そんなに大きな違いが出てることはないです。 BPBは横には広がりますね。で最後の方ではつながって一本線の様に見える。まあバッファーで違うかもしれません。最近はいろいろなバッファーしすてむがあるようですから。

(無題) 削除/引用 No.2662-9 - 2013/12/17 (火) 20:59:25 - qq まず何よりも、SDS-PAGEを日常的に行っている研究室を探すことです。 電気泳動メーカーのattoのHPにマニュアルのようなものがあります。良いかもしれません。 バイオ実験シリーズのような初心者向けのマニュアル本もありますから、大学図書館か本屋で探すと良いです。既成のゲルを使うのも、まずは感じをつかむ上で良いかもしれません。 ＞分離ゲルに入ってからBPBがにじむように広がりながら流れ、 まあ、あまりそんな風にはならないね。

(無題) 削除/引用 No.2662-8 - 2013/12/17 (火) 20:36:15 - ウェスタン初心者 先日はアドバイスをいただきありがとうございました。 学生実験で使っているガラス管とテフロン棒のホモジナイザーを使うことができ、 無事サンプルを処理することが出来ました。 本日、サンプルをSDS-PAGEしてみたのですが、さらに幾つか疑問点が出てきてしまいました。 一つ目は濃縮ゲルの大きさです。 教科書やいろいろなサイトを見てみますと、ゲルの組成は書いてあるのですが、 ゲル一枚あたりの実際のボリュームが書いてありませんでした。 ゲル版の大きさ次第ということではないかと思っていますが、 濃縮ゲルをどの程度作ればよいかわからず困ってしまいました。 とりあえず、コームの先端から1cm、と決めて作りましたが、 皆様はいかがされていますでしょうか？ さらに実際に泳動してみると、分離ゲルに入ってからBPBがにじむように広がりながら流れ、 バンドという感じにならなかったのですが、これは普通なのでしょうか？ 一応、先頭(?)部分は真っ直ぐでしたので転写まで進めて見たのですが。。。 タイトルと違う質問になってしまったのですが、ご意見をいただけますと幸いです。

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