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(無題) 削除/引用 No.2662-7 - 2013/12/16 (月) 03:16:07 - ウェスタン初心者 名無し様 ありがとうございます。 手でやるやつでいいんですね！ 実習室でガラスに入った先が白いやつを見た気がしますので探してみます。 組織重量とバッファーの比も勉強になりました。 蛋白定量もやはり必要ですよね。 先生には、 「内在性コントロールのバンドで補正すればいいはずだ」 と言われたのですが、、、 もう一度お願いしてみます。 調べてみるといろいろな方法があるようなのですが、どの方法が一般的なのでしょうか？ 溶出バッファーには界面活性剤が入っているので、影響を受けにくいBCA法でしょうか？ おお様 ありがとうございます。 乳鉢、ありました！ただ手を広げたくらいあってちょっと大きすぎるかも知れません。 ちょっと野生型マウスたちを使って試してみたいと思います。 教科書は羊土社のタンパク質実験ハンドブック生協で買ったのと、 アブカムの人からもらったプロトコール集(英語なのですが。。。) を使っています。

(無題) 削除/引用 No.2662-6 - 2013/12/15 (日) 22:48:38 - おお 蛋白は重量の10ぶんの一前後という目安で、WBとかで扱う時はまあ1-2ug/ulあたりがやりやすい濃度と思いますので、またあまり蛋白量が多い状態では抽出されていない可能性もありますので、どの程度の濃度になるかは考慮してバッファーを加えるといいかと思います。 初心者が1からWBを立ち上げるのは大変という指摘もありますが、まあ研究をしているとやったことのない実験系を立ち上げなければということもありますので、センスを磨くという面ではやってみてもいいのかもしれません。いろいろな詳しいプロとコールをよんでみてください。

(無題) 削除/引用 No.2662-5 - 2013/12/15 (日) 22:40:20 - おお いま乳鉢を持っているラボがどの程度あるかわかりませんが、よく冷やした乳鉢ですりすりすればできないことはないと思います。 金属メッシュがあるなら、バッファー存在かでそれに押しつけてつぶしていくとかして、太いニードルに通し、徐々にニードルの大きさを小さくしていくとか。メッシュがなければ、カミソリのはなどで細かく切り刻んでからニードルをつかうてもある。 まあ柔らかいのでなんとでもなるといえばそうだけど、ホモゲナイザーはほしいところですね。。。

(無題) 削除/引用 No.2662-4 - 2013/12/15 (日) 19:59:20 - 名無し 脳は柔らかいというか柔らかすぎてもろいくらいなので、ポッター型ホモジナイザー用のペッスルとガラス管、あるいはダンス型ホモジナイザー（モーターでなく手でつぶすガラス製のやつ）があれば機械（モーター）は不要だな。いずれも生化学とか分子生物学の実験をやってる部屋にいけば日常的に使うようなふつうにある器具なので、（買ってもたいした値段じゃないけど）借りればいいんじゃね。それをつかって、適当な可溶化buffer中で手で丁寧に６、７回程度回すようにおしつぶせばいい。器具やbuffer類はあらかじめ氷でよく冷やしておいたほうがいい。 とくに決まりがある訳じゃないけど、組織重量のおよそ10~20倍量のbufferを使う事が多いとおもう。 可溶化bufferはいろいろあるけど、すでに当該蛋白質の抽出についての文献があるならとりあえずまずはそれに準じるのがいいとおもう。bufferの組成により可溶化できる蛋白質できない蛋白質がある。インヒビターは添加した方がいい。あまり情報がなくて取り敢えず出来るだけ多くの種類の蛋白質を可溶化するならSDS-sample bufferがいいかもしれない。ただこの場合DNAがでてきて粘性が高くなることがあるので、その場合は超音波したほうがいい。それ以外のケースではとくに超音波は不要と思う。 ウェスタンするなら電気泳動に先立ち、組織抽出液の蛋白質濃度を定量する必要があるとおもうんだが、その試薬（キット）はあるのかな。可溶化bufferの組成によっては定量を妨害する成分がありかもしれないから、その点もあらかじめチェックしてから選定したほうがいい。 センセの言葉がほんとにその通りなら、非常に残念だけど、電気泳動を含めウェスタンはやや煩雑な工程が多く、文章では伝わらないコツみたいなのもあり、初心者がはじめから一人でチャレンジするのはちょっとハードルが高いとおもう。なので、もし初心者ならば十分に知識と経験のある人に指導受けた方がいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.2662-3 - 2013/12/15 (日) 18:18:13 - ウェスタン初心者 qq様 ありがとうございます。 PVDF膜などもなかったので相談したのですが、 「膜や発色基質は買ってもいいが、機械類は無いとダメなのか一回実験して見てからにしてくれ」 と言われました。 試薬もプロテアーゼ阻害剤などは無くてもできるはずだと言われ、買ってもらえていません。。。

(無題) 削除/引用 No.2662-2 - 2013/12/15 (日) 18:05:41 - qq それはホモジナイザーを買え、ということじゃないの？？ まあ、手軽なエッペン型のインスタントマッシャーも売っているけど、柔らかい組織だけであれば、適当なサイズのダウンス型ホモジナイザーが良いと思いますね。

組織サンプルからのタンパク抽出 削除/引用 No.2662-1 - 2013/12/15 (日) 17:41:10 - ウェスタン初心者 皆様のご意見をお願いします。 先日、教授から調べているタンパク質について 「マウスの脳での発現をウェスタンでみろ」と指示されました。 実験それ自体は筋が通っていると思うのですが、 今の研究室ではウェスタンブロットをやっている人が一人もおらず、 ホモジナイザーや超音波がありません。 たとえば、ピペッティングだけでタンパク質を可溶化してサンプルにすることはできるものでしょうか？

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