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ありがとうございました。 削除/引用 No.2674-5 - 2013/12/19 (木) 11:13:11 - たろう APさん さっそくのご回答をいただき、どうもありがとうございました。 大変よくわかりました。 これまで疑問に思っていたことが、ようやくすっきりしました。 GSPとrandom primer、それぞれにメリットがあるということですね。 いろいろ組み合わせて、試してみようと思います。 このたびは、どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2674-4 - 2013/12/19 (木) 10:46:09 - AP >ここでrandom primerを使う意味はないでしょうか？ 過去ログでもなんどか論議がありましたが、 逆転写酵素はprocessivityが低い（一度鋳型に取り付いた酵素が離脱しやすく伸長性が高くない）、鋳型の二次構造に弱いという仕様です。 そのため、oligo-dTやGSPで逆転写したとき、伸長が不完全な鎖ができやすく、プライマーに近い配列ほど多くcDNAに変換され、遠い方は変換されにくいというバイアルがかかります。RNA全体をバイアスなくcDNAにするにはランダムプライマーの方が優れていて、定量PCRのようにバイアスを排除したい場合には適しています。 あるRNAやそのCDSの全長を含むcDNAを得たいというときには、もちろんoligo-dTやGSPが第一選択です。全長まで伸びきったcDNAは稀かもしれませんが、とにかく一個でもそう言うのが取れれば良いわけで。 二次構造の影響や配列が極端に長いためにどうしてもそう言うのが取れないこともあります。そういう場合にランダムプライマーを使ったcDNAでプライマーウォーニングするとか、RACEをするとか、というケースはありえます。

投稿者です。 削除/引用 No.2674-3 - 2013/12/19 (木) 10:23:41 - たろう APさん どうもありがとうございました。 >標的配列の全長まで伸びた1st strand cDNAを鋳型にすることによって、 >長い産物が得られたことになる ということですね。 お手数ですが、もうひとつご意見いただけますか？ 私の実験で、long RT-PCRで増幅したいRNA領域10kbがあります。 この両端部分の配列だけがわかっているので、 ここにspecific primerを設計して、long RT-PCRをしたのですが、 増幅できませんでした。 そこで、ためしにRTをrandom primerで行ってみてはどうか、 と思った次第です。 >１つ１つの1st strand cDNAの長さは短かったとしても、 >これらを次々と渡り歩くことで、結果的に長いPCR産物を得られる ということがないのであれば、 「random primerよりは、specific primerを使った方が、 RTは長く伸びる」というイメージがありますし、 ここでrandom primerを使う意味はないでしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2674-2 - 2013/12/19 (木) 07:33:19 - AP >標的配列の全長まで伸びた1st strand cDNAを鋳型にすることによって、長い産物が得られたことになるのでしょうか？ こっちです。

ランダムプライマーを用いたRT-PCRの原理 削除/引用 No.2674-1 - 2013/12/18 (水) 22:42:59 - たろう 基本的なことで恐縮ですが、 ランダムプライマーを用いたRT-PCRの原理について教えてください。 ランダムプライマーでcDNAを作らせた場合、 RNAのいろいろな領域に対して、いろいろな長さの1st strand cDNA （つまりcDNAの「ミックス」のようなもの）ができますよね？ このようなcDNAに対してPCRを行うと、 １つのポリメラーゼが、いくつかの異なるcDNAを渡り歩いて、伸張反応を行うことができるのですか？ それとも1つのポリメラーゼは、初めから終わりまで、１種類のcDNAに結合したまま、伸張反応を行っていくのですか？ たとえば、long PCRで増幅が確認できたとします。 このとき、１つ１つの1st strand cDNAの長さは短かったとしても、 これらを次々と渡り歩くことで、結果的に長いPCR産物を得られたのでしょうか？ それとも、標的配列の全長まで伸びた1st strand cDNAを鋳型にすることによって、長い産物が得られたことになるのでしょうか？

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