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解決しました 削除/引用 No.2697-15 - 2014/01/03 (金) 15:00:24 - 崖っぷち 皆様、ご意見ありがとうございます。 事態は無事解決し、C2C12細胞が再び正常に飽和、分化するようになりました。 結論から申しますと、原因は冬場の寒さした。 12月中〜下旬は研究室のメンバーも多忙で、インキュベータの扉を頻繁に開閉しておりました。 その結果、部屋の冷気が入り、インキュベータ内の温度が設定より低い状態が続いていたようです(もちろん湿度、CO2濃度も低下しがちです)。 年末年始の人気の少ない時期を狙い、かつ部屋の暖房を24時間ONにして細胞培養を行ったところ、細胞は正常に増殖と分化しました。 なお、HEPESによるpH調節や、2倍のFCSを添加した細胞でも大差はありませんでした。 大変お騒がせしました。 重ねてお礼申し上げます。 追伸 私どものC2C12細胞は、飽和に近づくと1日で血清を食いつくし、老廃物で培養液のpHを下げます。 普段と同じ様子であったため、コンタミの可能性は低いと判断いたしました。 また、使用しているインキュベータですが、CO2の供給が遅いです。 私以外の培養ディッシュも、フェノールレッドが赤い状態が続いていますので、インキュベータの設定変更や点検をしておこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.2697-14 - 2013/12/30 (月) 14:26:19 - お正月。 訂正：マイコプラズマが壊すのはグルタミンじゃなくてアルギニンでした。

(無題) 削除/引用 No.2697-13 - 2013/12/30 (月) 12:55:31 - けい >追い打ちと申しますか、老廃物が溜まって次第に黄色く変色するので、pHはかなり上下しています。 自分の場合、C2C12は中一日ぐらいで継代していますが、これまで培地が黄色くなることはなかったです。やはり、なにかコンタミしていたりしませんか？

(無題) 削除/引用 No.2697-12 - 2013/12/28 (土) 21:58:13 - お正月。 細胞の調子が悪くてかつ、しばらくの期間培養して細胞がそれなりに増殖した後も培地の赤みが目立つならマイコプラズマのチェックしたほうがいい。あれの仲間にはグルタミン分解してpH上げるやつがいる。

(無題) 削除/引用 No.2697-11 - 2013/12/28 (土) 18:42:45 - na na shi 参考情報として・・・。 インキュベーターの設置場所を変えたり、停電があったり、電源コンセントのつなぎ替えを行うと、ゼロ点校正が必要になる場合があります。 これを怠ると、表示されているＣＯ２濃度と、実際のＣＯ２濃度に差が生じることがあります。

(無題) 削除/引用 No.2697-10 - 2013/12/28 (土) 17:24:59 - おお http://www.wakenbtech.co.jp/index.php?page=shop.product_details&flypage=shop.flypage&product_id=145&option=com_virtuemart&Itemid=29 インキュベーターのCO2は上記のような簡易測定器ではかれます。どこのラボでももっているとはいえませんが、周りのラボめぐりでもすればどこか持っていても不思議ではないとおもいます。 培地はたしかにボトルからとってインキュベーターにいれると若干赤く偏ることがあります。まあ明るい赤であればそれでも大丈夫です。実際に色を見せれいるわけではないので、そうはいってもわからないかもしれませんけど。 初心者向けも、日本語のプロとコール集に色が実際に示されてたようなきがします

(無題) 削除/引用 No.2697-9 - 2013/12/28 (土) 15:56:20 - mbb >[Re:8] むーさんは書きました : > インキュベータに関しては業者にチェックしてもらったほうがいいです > フェノールレッドが赤くなるほどということは炭酸の供給かセンサーがイカれてる可能性が高い > 横からで失礼します。 うちのインキュベータもDMEMをいれておくとボトルから 出したときと比べてずいぶん赤くなります。 培養に支障はないようなので、こんなものかと思っていたの ですが、赤くなるのは異常なのでしょうか？ そういえばCO2濃度は1年以上チェックしていないし。。。

(無題) 削除/引用 No.2697-8 - 2013/12/28 (土) 12:40:25 - むー インキュベータに関しては業者にチェックしてもらったほうがいいです フェノールレッドが赤くなるほどということは炭酸の供給かセンサーがイカれてる可能性が高い

(無題) 削除/引用 No.2697-7 - 2013/12/28 (土) 11:43:37 - 崖っぷち 皆様、アドバイスありがとうございます。 まず、マイコプラズマ等のコンタミですが、完全には否定できない状況です。 予算の都合上、培養液には抗生物質を入れずに使用しております・・・。 案の定、他の研究室メンバーもちらほらコンタミしていますが、私の様に全滅はしていない様子です。 そして、培養液と血清ですが、培養液は購入したばかりのものを使用しております。 4℃保存しておりますので、製品の劣化は心配ありません。 血清は-30℃の凍結保存をしておりますが、細かくチェックしていませんでした。 新しいボトルの培養液と血清に切り替えて以降も症状が出ておりますので、まとめ買いした全ての商品に問題があったのでしょうか・・・。 次に、インキュベータですが、扉の開閉の頻度が高く、温度・湿度・CO2濃度は低下しがちです。 現にインキュベートすると、フェノールレッドがピンク寄りの赤色になります。 追い打ちと申しますか、老廃物が溜まって次第に黄色く変色するので、pHはかなり上下しています。 皆様のご意見をもとに教官と相談した結果、次の対策に出ることに致しました。 1. FBS濃度を20%に上げる（確かに、このC2C12はかなり血清を食らいます）。 2. 10% FBSに10mM HEPES　pH7.4を添加する。 3. 常時、部屋の暖房をONにする(多少なりとも扉開閉時の被害を軽減？)。 これらの条件で培養し、様子を見守りたいと思います。 何かの折に、結果をご報告いたします。

(無題) 削除/引用 No.2697-6 - 2013/12/28 (土) 00:01:24 - おお まいこぷらずまは一度疑ってみた方がいいと思います。けいだいすることで数が減りますのでけいだい後はしばらく細胞は平気な顔をしていたりします。

(無題) 削除/引用 No.2697-5 - 2013/12/27 (金) 20:48:50 - qq DMEMは、グルタミン添加済みの液体培地を買っているのでしょうか？ DMEMが古くなりすぎている可能性はないだろうか？out-dateだったり、そうでなくとも、予期しない理由で、分解が促進してしまったとか。 グルタミンが分解してしまっているとか、ビタミンがヘタっているなどです。 根拠は特にないのだけど、特定の栄養素が激減しているので、細胞が多くなると早く枯渇してしまう可能性を考えてしまう。

(無題) 削除/引用 No.2697-4 - 2013/12/27 (金) 19:33:22 - ~ 炭酸インキュベーターの温度は確認しましたか？ 気温が下がったことが原因であるとすれば、作業時間中の低温曝露よりも、インキュベーターの保温が限界になる方があり得るかと。 それよりも、血清のロット変更時のロットチェックのデータは見直しましたか？ また、切り替えのタイミングと増殖悪化のタイミングはずれていますか？一致していますか？ メーカーやカタログ番号が同じだから気にしなくてもいい、という性質のものではありません。 飽和の手前で継代した場合、ちゃんと継代できるのですか？ できるのであれば、マイコ等の汚染は考え難いと思います。 逆にそもそも継代できないのであれば、セルストックが汚染または痛んでいるのかもしれません。 何を使った時にきちんと継代できていて、 何を変えたタイミングでダメになったのかを追跡してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2697-3 - 2013/12/27 (金) 17:46:19 - むー 冷蔵庫から出したばかりの培養液をぶちまけても特に問題なく増える培養細胞が大半ですから気温で死ぬってことはそうそうはないと思います 飽和の手前までは生きていてしかも増殖もしているんですよね？ だとすれば栄養条件などには問題はないのでしょうねえ 考えられる可能性としてはインキュベーターの設定が狂ってるとかかなぁ センサーそのものが狂ってると見た目上は正常に見えても34度になってたりCO2濃度が上下してたりすることがあるんです。うちの研究室ではそんなことがありました

(無題) 削除/引用 No.2697-2 - 2013/12/27 (金) 17:28:09 - けい 書かれた情報を見るに、特に原因が思いつきませんが、 例えば、マイコプラズマ等が細胞や試薬にコンタミしていたりしませんか？

培養細胞が死んでしまいます 削除/引用 No.2697-1 - 2013/12/27 (金) 17:19:36 - 崖っぷち いつも大変お世話になっております。 現在、私はマウス筋芽細胞のC2C12を使った実験を行っています。 培養条件としまして、10% FBS/DMEM (+1mM ピルビン酸)で増殖させ、飽和に達した際に2% HS/DMEMに交換し、分化誘導をかけております。 また、インキュベータは37℃、湿度95%、CO2濃度5%に設定しております。 従来はこの条件で問題なく細胞が増殖・分化していたのですが、最近になると飽和の手前(約8〜9割)になると細胞が死んで浮き始めます。 強引に分化誘導をかけても筋管に分化せず、ただ死細胞の数が増える一方です。 継代回数が増えたわけでもなく、培養液や血清のメーカーも変更していません(ただし、商品は同じでもロットは変わっています)。 ただ、今までと変わった事と言えば、季節がら気温が冷え込んできたことです。 クリーンベンチから吹き付ける風は冷たく、培養液の交換時に細胞が冷却された恐れがあります。 気温が下がることで、培養細胞が死に至ることはあるのでしょうか。 もしくは、他に原因があるのでしょうか。 何卒、ご教示のほどよろしくお願い申し上げます。

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