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(無題) 削除/引用 No.2701-9 - 2014/01/06 (月) 20:08:35 - どんとこい 約14 kb くらいのサイズのプラスミドを扱って10^6程度のライブラリーを作製した経験がありますが，17 kbは未体験なので、やれといわれても短期間で成功する自信はありません。 お役にたつかどうかわかりませんが、注意点をあげると、 １　DNAのゲル抽出は、効率がとても悪いのでなるべく使わない ２　プラスミドサイズも10 kbを超えるとケミカルコンピテントセルの効率が極端に下がる ３　インサートとベクターの比は殆ど問題になったことはない ４　それより両者のDNA濃度を上げる努力が大切 ５　10 kb超えるとDNAは溶けにくくなるので，エタ沈など極力しない ６　ligationはよっぽどのことがないかぎり、うまくいっている、安心してよい ７　ベクター側（Amp）とインサートのベクター（Kanamycin）を異なるものにすべき ８　プラスミド切断後，可能ならインサートのマルチクローニングサイトにあるユニークサイトを切断し、ごく短い断片（50 bp 以下）を切り出し、Amicon ultra 100K などのフィルターで３回filtrationしてその短い断片を除くとよい ９　同様にベクター側も、もしlinkerのようなごく短いものが切り出されてくるようなら、Amicon ultra 100K などでのぞくとよい １０　上の心得に従い、エレクトロポレーションをつかうと（出発は、それぞれ10 ug 程度のプラスミド）、約14 kbのプラスミド(insertは0.3~0.6 kb)で、10^7程度のコロニーが得られ、きちんとインサートが入っている効率は60~70%くらいになる １１　ご成功をお祈りしています

(無題) 削除/引用 No.2701-8 - 2014/01/06 (月) 17:17:50 - 波平 単純にライゲーションに用いたゲル抽出で調製した15 kb断片が少ないだけではないでしょうか？ プラスミドが大きくなれば形質転換効率はかなり下がります。 ライゲーション効率と形質転換効率を考慮して下さい。 タカラバイオのHPより ケミカルコンピテントセルの場合、プラスミドサイズが10 kbを超えると導入効率が50%以下に低下し、18 kbでは約10%程度となります。サイズの増加に伴い効率は低下しますが、40 kb程度のアデノウイルスプラスミドもケミカルコンピテントセルでクローニング可能です（pUC系のプラスミドの場合、サイズ増加に伴い複製、分配が不安定となりサブクローニングが困難になります。サイズの大きなDNA、安定性に問題のあるDNAはpBR系の低コピープラスミドをお使いください）。同じK12株の大腸菌でも変異の有無によって大きなサイズのプラスミドの形質転換効率は異なる

(無題) 削除/引用 No.2701-7 - 2014/01/06 (月) 08:31:45 - Harmonia APさんと monさんに追加で： ライゲーションの反応液を電気泳動すると、2kb同士がくっついた4kbがみえる はず。それが起こってないなら、ライゲースが働いていないかも。

(無題) 削除/引用 No.2701-6 - 2014/01/06 (月) 04:41:48 - おお >[Re:5] 中年さんは書きました : > > 制限酵素消化が十分に行われているなら、切り出しを行わなくとも元のインサートが優先的にクローニングされる理由はありませんので、モル比が1:1だとしても50%の確率で欲しいコンストラクトが取れるはずですし、1:5ならその確率はさらに上がるでしょう。 そうか。きった断片が同じぐらいの長さなのでそうかもしれません。もともと入っている2kb内で切れる制限酵素でベクターを切らないものがあれば、それで消化すると、末端がコンパチブル出ない限り、(入れたいフラグメント存在かで)再びベクターにライゲーションされることがなくなるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2701-5 - 2014/01/05 (日) 20:11:48 - 中年 10kbを超えるようなDNA断片の場合、私ならゲルからの切り出しは行いません。標的サイズが大きいのでUV感受性がぐっと高くなりますし、ゲルからの回収率も下がるし、ゲルからの回収方法によってはせん断を受けてスメアするし、百害あって一利なしというのが私見です（可視光で検出できる染色法を使う、アガラーゼや低融点アガロースを用いて回収する、などするならこれらの問題を回避することは可能ではあります）。 制限酵素消化が十分に行われているなら、切り出しを行わなくとも元のインサートが優先的にクローニングされる理由はありませんので、モル比が1:1だとしても50%の確率で欲しいコンストラクトが取れるはずですし、1:5ならその確率はさらに上がるでしょう。もし、切れ残りがあってone-cutの分子が優先的にクローニングされるような事情があるなら、CIAP処理をして自己環状化を防ぎます。 ところで、形質転換後、カナマイシン入りのプレートにまき出す前に、抗生物質抜きの培地でポストカルチャーはしていますよね？

(無題) 削除/引用 No.2701-4 - 2014/01/04 (土) 16:06:06 - おお まず、インサートなしのネガティブコントロールを10ー50ngとかつかってコロニーが全く出ないのであれば、よほど特殊な場合でない限り、ちょっとコンピテントの効率が悪いか、DNAが痛んでいるかと思ってしまいます。 比率はちっと多いかもしれませんが、100倍とかならない限りまあだいじょうぶかなぁとおもいますが、極端にインサートが多い場合トランスフォーメーション効率が落ちます。ただしポジティブのクローンの比率は多くなる傾向にありますが、もともとのコンピテンシーが低く、さらに効率が落ちるとめもあてられませんね。

(無題) 削除/引用 No.2701-3 - 2014/01/04 (土) 15:27:29 - mon APさんに大いに賛成ですが、追加で、 >15kb側：2kb側＝1：5程度の比率で行いました。 もしこれが量比なら、モル比1:35になるけど？チョット多いか。 この比率でも、ligaseを熱失活させて、BamHIで切断、self-ligationすると、多重インサートによる欠失等は防げます。 あきらめるために、BamHIで切断、ゲルから切り出し、self-ligationすることもあります。 まあ、（原因不明で）クローニングしづらいplasmidであるため、まだまだコンピの効率が低い、あるいはDNA量が少ない可能性も捨てきれません。

(無題) 削除/引用 No.2701-2 - 2014/01/04 (土) 13:34:32 - AP まいどワンパターンのコメントですが、 切りだしの時にUVあてすぎなんではないですか。 とくに15 kbのような長いDNA断片の場合、的が大きいのでDNA鎖のそれぞれの分子のどこかしらにピリミジンダイマーが生じる確率が高くなります。 理想的にはまったくUVをあてないのがいいです（可視光で見える色素で染めるとか、位置決めに必要なレーンだけUVをあて、切り出すレーンはUVを当てないとか）。

ダブルダイジェスト→ライゲーションが成功せず困っています 削除/引用 No.2701-1 - 2014/01/04 (土) 12:04:54 - Kak 　お初に書き込ませていただきます。 　私は現在、約17kbという比較的大きなプラスミドクローンのうち、約2kbの断片を取り換えるようなクローニングを試みています。 　17kbのクローンの中にはBam HIとSwa Iサイトで挟まれた約2kbの領域があります。これを同制限酵素で処理して15kbと2kbに分けます。電気泳動して、15kb断片をゲルから切り出します。 　そして同じ末端を両側に持つ別の2kb断片（これは元はｐUC18の中に入っており、これもBam HI・Swa I処理してゲルから切り出しました）を上記の15kb断片とライゲーションすることで、新しい別の17kbのクローンを作りたいのです。 　なお、15kb側にはカナマイシン耐性遺伝子が入っており選抜可能です。 　ところが、ライゲーション・大腸菌への形質転換を試みたところカナマイシン添加プレート上に全くコロニーが得られませんでした。 　ライゲーションはバンドを見ての目分量ではありますが、15kb側：2kb側＝1：5程度の比率で行いました。形質転換については、同時に元の17kbクローンでの形質転換をコントロールとして行ったところ多数のコロニーが得られました。 　ライゲーションがうまくいっていないのがコロニーが得られていない原因なのではないかと私は考えているのですが、どのように改善したらよいか、ご教示いただければ幸いです。

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