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(無題) 削除/引用 No.2728-19 - 2014/01/15 (水) 19:20:22 - 確認できました monさん、おおさん ありがとうございます。論文から要点を確認できました。 After 1 volume of DNA sample was mixed with 0.2 volume of TXS solution　(6% [w/v] Triton X-114 and 3.0% [w/v] SDS. Oil red could be added to TXS solution to act as an indicator.), the clear mixture was incubated at room temperature for 10 min. After adding 5 M NaCl to a final concentration of 1.0 M and mixing well by hand shaking, the mixture was centrifuged at 12,000g　for 10 min at room temperature. The upper aqueous phase was transferred to a fresh Eppendorf tube, and the extraction procedure was repeated two more times. Plasmid DNA in the final aqueous phase was precipitated with an equal volume of isopropanol at room temperature. After washing the precipitate twice with 70% ethanol at 4 C and air-drying,the plasmid was redissolved in sterile distilled water and quantified. この論文は、非常に貴重ですね。シリカも自作できますね。

(無題) 削除/引用 No.2728-18 - 2014/01/15 (水) 19:09:49 - AP たまたま見つけました。 トランスフェクション用のプラスミド大量に取る試みで、 KOAc→NH4OAcの塩析操作のみでやっています。 http://link.springer.com/article/10.1023/A:1013106032341

(無題) 削除/引用 No.2728-16 - 2014/01/15 (水) 17:44:54 - mon 以下の論文は、通常のアルカリSDS後、シリカ粒子で精製し、TX-114でEndotoxinを除去しています。自作出来ますよ。 Ma, R., Zhao, J., Du, H.-C., Tian, S., & Li, L.-W. (2012). Analytical Biochemistry, 424(2), 124–126. doi:10.1016/j.ab.2012.02.015 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269712001054

(無題) 削除/引用 No.2728-15 - 2014/01/15 (水) 16:07:08 - おお 具体的に書かなかったのはいま仕事場にいないのでてもとにありません。。。あとでできれば追加します、pubmedとか検索で簡単に引っかかると思いますけど、、、

(無題) 削除/引用 No.2728-14 - 2014/01/15 (水) 14:24:51 - 確認させて おおさん =TX-114を使ってます。温度を上げて分離させる方法でやってましたが、塩濃度を上げて分離させる方法もあるようなのでそちらでやっています すみません、具体的なプロトコルを教えてください。 できましたら、次のプロトコルなどと組み合わせて、 http://www.nara-wu.ac.jp/bio/molbio/protocol/PlasmidAlkali_SDS.html どのステップから、どのような液を添加、などの形で教えていただけると有り難いです。

(無題) 削除/引用 No.2728-13 - 2014/01/15 (水) 13:30:51 - おお 私もミニプレっぷはカラムより昔のsol I/II/IIIでうまくこなした方が早いなあという感触をもってます。APさんの指摘する酢酸アンモニウムの方法は私もやりまして、いい感じです。 スピンカラムとかだと遠心、取り出しflow throughを廃棄、溶液をアプライという操作が何回か繰り返さないといけませんが、1ちゅうぶでI/II/IIIで遠心じょうせいをイソプロパノーるの入ったチューブにうつして遠心という過程ならカラムよりは楽です。 ボリュームが許せば飽和尿素を等量加えエタチンというのもよくやります。これは文献などのリファレンスがないので勧めていいかどうかわかりませんけど、除蛋白、まんまるの細胞にたいしての毒性物質(おそらくLPSが除去されているんだろうと思っている)の除去ができます。 LPSが除去されているということがしっかりわかっている方法論でないと都合が悪いときはTX-114を使ってます。温度を上げて分離させる方法でやってましたが、塩濃度を上げて分離させる方法もあるようなのでそちらでやっています。 もともとプラスみど精製をふくめキットがあまり好きではない性分でしたので、こんな感じでプラスみど精製はこなせてます。

(無題) 削除/引用 No.2728-12 - 2014/01/15 (水) 11:33:13 - 中年 APさま、ありがとうございました。 示していただいた参照スレッドのFocusのリンクが読めなくなっていて、自分でも探してみたんですがやっぱり見つかりませんでした。Focusは他にもいろいろ役に立つ記事があったようなので、Life Technologiesも良い宣伝になると思うのですが。 ともかく教えていただいた情報を元に実際に試してみます。

(無題) 削除/引用 No.2728-11 - 2014/01/15 (水) 10:42:43 - AP pUC等、高コピー数プラスミドなら、収量はmL LB cultureあたり2-3 ugというところだと思います。TBなどリッチな培地なら（体積あたりの菌数が数倍多くなるので）収量もそれなりに増えます。 Alkali/SDSのスケールアップは、任意のスケールで行なうことができます。 ただし、大きいスケールで菌数が多い場合、参照スレッドにもあるようにSol1懸濁時にlysozymeを1 mg/mL程度加えるのがいいです（Sol1に最初から入れておいてもいいけれど、菌沈殿の表面がベトっとして菌が懸濁しにくくなるので、So11で再懸濁してから加えるほうが無難）。 トランスフェクション用のプラスミドなら、エンドトキシンを除く処理を加えるにしても、塩析だけだと不安です。フェノール抽出くらいは必要じゃないでしょうか（そういう目的ではフェノール抽出を省いた経験がない）。Triton X-114は単品でも買えますし、エンドトキシン除去への用途は過去スレでもでていましたし、文献検索すると複数の原著がすぐに見つかります。

(無題) 削除/引用 No.2728-10 - 2014/01/15 (水) 08:55:52 - 確認させて AP様 ありがとうございました。 もうひとつ教えてください（あかねさん、便乗すみません）。 教えていただいたプロトコルで、pUC系のプラスミドをDH5αなどの大腸菌からプレップする場合には、どの程度の培養スケールまで実施できて、何マイクログラムぐらいまでのプラスミドをとれるでしょうか？大雑把な数字でもちろんかまいません。 また提示された参照スレッドででてきている、エンドトキシン除去試薬 溶液 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e4274?lang=ja&region=JP で後処理をすると、大きな培養スケールからも、教えていただいたプロトコルによってエンドトキシンフリーなプラスミドをとれると理解してよいでしょうか？ そうであれば、完全にカラムから移行して、トランスフェクション用のプラスミドを調製したいです。

(無題) 削除/引用 No.2728-9 - 2014/01/15 (水) 07:37:51 - AP >酢酸ナトリウム沈殿による除タンパク質はしたことありません 2M 酢酸アンモニウムでの再懸濁・再沈殿のことです。

(無題) 削除/引用 No.2728-8 - 2014/01/14 (火) 23:33:41 - AP >7.5 M NH4OAc調製が楽というのは、粉末を溶かすだけで良いからでしょうか？除タンパク効果が高いというのは、何か典拠があるでしょうか？ 参照スレッドはこちらです。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=1256 旧BRL（現Invitrogenかな）の情報誌Focusの記事が原典です。 >おしゃるプロトコルは、次のものと完全に同じですか？ 概ねそのとおりです。異なる点は（といっても経験からくる流儀の違いだけで本質的では無いですが） Sol1は、原法ではそこに書かれているとおりTEG (Tris buff/EDTA/Glucose)ですが、TEやSTE（NaCl/TE)でも問題ないようです。プラスミド精製のためだけの試薬であるTEGをわざわざ作らないで汎用性のある試薬で代用することができます。 このスケールのミニップレップであれば、Sol2を加えたあと混和しません。ピペットで勢い良くSol2を吐き出せば、それで十分混和されます。ここで転倒混和したりすると、ねばねばのライセートがフタについてしまうので、スピンダウンをせざるを得なくて面倒ですので。 Sol3を加えるときにクロロフォルムを一滴くらい加えます。このステップでボルテックスかけるのはまずいと思います（ゲノムDNAを含んだ沈殿が細分化して上清に混じりやすくなる）。転倒混和で優しく混ぜます。 酢酸ナトリウム沈殿による除タンパク質はしたことありません（必要を感じません）。必要であればフェノール/クロロフォルム抽出やNaCl/PEG沈殿を加えます。

(無題) 削除/引用 No.2728-7 - 2014/01/14 (火) 22:46:04 - 確認させて AP様 おしゃるプロトコルは、次のものと完全に同じですか？ http://www.nara-wu.ac.jp/bio/molbio/protocol/PlasmidAlkali_SDS.html もし違う点があれば教えてください。

(無題) 削除/引用 No.2728-6 - 2014/01/14 (火) 21:58:31 - 中年 カラム無しに一票。チマチマとカラムを並べるよりずっと楽だと個人的には思います。 これまで5M KOAcを使ってきたのですが、7.5 M NH4OAc調製が楽というのは、粉末を溶かすだけで良いからでしょうか？除タンパク効果が高いというのは、何か典拠があるでしょうか？＞APさま

(無題) 削除/引用 No.2728-5 - 2014/01/14 (火) 10:52:28 - AP 質問の答えではないけれど、キットを使わないのがもっとも安上がりでは？ 以前のスレッドでも述べたことがありますが、 アルカリSDS法で塩析の後（ここまではどのキットでもやることは同じ）、フェノール抽出をスキップしてEtOH pptすれば、たいていの用途には使用できる品質のプラスミドがとれます。スループットもキットを使うのと同等か、それ以上です。 塩析のステップで1/2 vol 5M KOAc bufferではなくて1/2 vol 7.5 M NH4OAcにすれば、さらに除タンパク質の効果が高い上に、ストック溶液の調製も楽です。また、少量のクロロフォルムを添加すると、塩析の沈殿が底のほうにパックされるので上清が綺麗に取れます。フェノール抽出をスキップすると、プラスミドの保存性にやや難がありますが、最終的なプラスミド溶液を65-70℃で10-15分加熱してDNaseの残滓を殺してやることでかなり安定します。RNAの残滓が気になるようならプラスミドを溶解するTEにRNaseを少量入れておきます。 サブクローニング等のスクリーニングの時、私はいきなり数クローンをこの方法でとって分析して、あたりのプラスミドを選んでフェノール抽出でさらに精製してダウンストリームの実験に使用する、という方法をよくとります。 スクリーニングする対象数を多くしなければならないときは、ボイル法を使うこともあります。ただし、この方法では収量、品質ともスクリーニング以外の目的には向きません。

(無題) 削除/引用 No.2728-4 - 2014/01/14 (火) 08:25:50 - TS わたしも日本ジェネティクスが良いと思います。 LBカプセルが付いてくるのもうれしい。

(無題) 削除/引用 No.2728-3 - 2014/01/14 (火) 08:15:48 - おお 最近はスピンからむだけとかうってたりするんじゃないかな。。。

(無題) 削除/引用 No.2728-2 - 2014/01/14 (火) 08:13:39 - aji 安くて質もいいと思います。 以前は数回分の試供品をもらえましたが、今は分かりません。 http://www.n-genetics.com/product_detail.html?item_id=4480

安価なミニプレップカラムキット 削除/引用 No.2728-1 - 2014/01/14 (火) 06:23:57 - あかね タイトル通り、安価なミニプレップカラムのkitを探しています。 各社からいろいろ出ているようですが、ここの製品が安いという情報があれば、お願いします。

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