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(無題) 削除/引用 No.2751-6 - 2014/01/21 (火) 17:44:22 - おお 菌体の破砕がむずかしいのであればzymolyaseを使う手もありますが。。。でもその必要性を感じるといえばうそっぽいですが。クロンテックのハンドブックにはcolony liftingが一番感度がいいと書いてはいますね。たしかに指摘があるようにトリッキーなのかもしれませんしcolony liftingは定量的ではありません。溶液で蛍光をつかって測るのも感度はいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2751-5 - 2014/01/21 (火) 17:07:06 - おお lacZでポジになるほど相互作用が強くない可能性もありそうですが。。。 酵母にプラスミドが入っていて、それが機能しているかどうかを確認したいのであれば、誘導した状態で培養して回収後WBで見てみるのもてかもしれませんが、発現ベクターによっては発現していてもあまり強い発現でなく検出が難しいものもあるようです。

(無題) 削除/引用 No.2751-4 - 2014/01/21 (火) 12:55:10 - 弘法 形質転換には問題なさそうですね。Invitrogenのシステムは使った経験がないのですが、一般論としてlacZフィルターアッセイにはtrickyなところがあります。溶菌の効率が悪い上に、preyによっては溶菌を促進してしまうようで、lacZの発現量と青色の発色が相関しないことも多いです。「液体窒素→室温で融解」を３〜５回くらい繰り返すと溶菌の効率が上がると思います。 X-α-galはClontechのシステムで使われるもので、酵母が本来持っているMEL1遺伝子がGal4で誘導されることを利用するものですが、株によってMEL1を持っているものと持っていないものがあるようで、お使いのMaV203がそのどちらに相当するかはわかりません。GAL4のポジコンで試してみる必要があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2751-3 - 2014/01/21 (火) 12:42:18 - ｍｍ 迅速な回答ありがとうございます。 使っている酵母はインビトロジェン社のMaV203です。 またポジコンのプラスミドにはbait にpEXP32/krev1を preyにpEXP22/RalGSDをもちいています。 MaV203は-L、-Ｗでは生えないようでbaitにはLeu2 preyにはTRP1がありそれぞれを組み込むことで-L,W環境でも生えるようになっております。 （実際にそれぞれ-L,Wそれぞれの環境で形質転換前,bait,preyと3つの段階で確かめてみましたが、ここでは問題ありませんでした） ご指摘いただいた通り、一度液相のx-gal法やX-α-Galについて調べて行ってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2751-2 - 2014/01/21 (火) 12:25:55 - 弘法 使ってる酵母の株は何ですか？株によってはlacZの発現が低いものもあります。また、ポジコンのプラスミドは、large Tとp53の組み合わせでしょうか。 面倒でも、フィルターアッセイではなく、グラスビーズで菌体を壊すなどして、液相でlacZアッセイをしてみることをお勧めします。こちらの方が感度が高いし、定量性があるので。 株によってはX-α-Galを使って青白アッセイもできます。こちらの方が結果のバラツキは少ないと思います。 形質転換が成功しているかどうかは、栄養要求性が相補される（Clontechのシステムなら-WLで生えるようになる）ことで確認します（もともと-LWプレートで生えない株を使うことが前提ですが）。

yeast two-hybrid法でx-gal染色が失敗する 削除/引用 No.2751-1 - 2014/01/21 (火) 11:47:49 - ｍｍ 生物系の学生です yeast two-hybrid法を用いて相互作用を示すタンパク質のスクリーニングを行っているのですがx-gal染色でポジティブが得られません。 His3とLacZにて選別を行っているのですが、-H培地ではコロニーが得られるものの得られたコロニーに対してx-gal染色を行っても青く染まるコロニーが得られません。 x-gal法は-H寒天培地の上に滅菌済み濾紙をしき、その上に-Ｈの条件で生えてきたコロニーを[30℃、3days]の条件で培養。生えてきたコロニーを液体窒素に入れ、x-gal 20mg/mlを10ul、Ｚ-buffer 1ml、2-mercaptoethanol 6ulを混ぜたx-gal solutionにて浸し[37℃]で発色が出るまで経時変化を見るという手法で行っています。 また、ポジティブなプラスミド（絶対に結合すると分かっているものbait,prey）を形質転換した場合も同様の結果（-Hでは生えるもののx-gal法では染まらない）となっております。他に、LacZ,GAL4が組み込んである市販のコントロールでは同様の手法で青く染まりました。 私が、考えている原因として、 ・現在用いている酵母自体に問題があり、形質転換がうまくできないあるいはタンパク質間の相互作用が起きない ・形質転換自体が失敗している あたりを考えています。 寒天培地の組成、形質転換法はプロトコルに従い注意を払っておこなっているので形質転換自体は問題ないのではないかと思うのですが・・・ この場合考えられる原因はなんでしょうか。心当たりがある場合助言頂けると幸いです。

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