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(無題) 削除/引用 No.2797-5 - 2014/02/06 (木) 14:39:05 - つん まとめてのお礼となりますが、皆様ありがとうございます。 > GPCRでしょうか。 そうです。GPCRです。 相性の問題もあったりするんですね。知りませんでした。 >他の細胞とはshneider2のような昆虫細胞でしょうか？ sf9細胞において、リガンドに対するdose-responseが確認できています。 念のため、細胞の種類を変えても再現できるか見てみようとしていたところでした。 > 糖鎖修飾の違いとか関係ないですかね。 > あとは、N末にプレドメインがあるけど上手く切断されていないとか。 > HighFive細胞に発現させた受容体に、リガンドが結合できる事は確認できていますか。 受容体-リガンドの結合は直接は調べていませんが、同様の条件で感染させたHigh five細胞を用いたcAMP assayでdose-responseが確認できていますので、結合できていると考えています。

(無題) 削除/引用 No.2797-4 - 2014/02/05 (水) 16:08:39 - 中年 GPCRでしょうか。GPCRとGαには相性があるので、ましてや生物種が違えばうまく共役しないこともあるでしょう。Sf9の例ですが、比較的えり好みの少ないGα16を共発現させて機能再構成させている例を見たことがあります。

(無題) 削除/引用 No.2797-3 - 2014/02/05 (水) 14:54:05 - qq ＞他の細胞では、目的の受容体-リガンドの組み合わせで細胞内カルシウム の、他の細胞とはshneider2のような昆虫細胞でしょうか？それとも哺乳類細胞での結果であれば、普通の昆虫細胞でシグナルがちゃんと入るのかを調べると良いなあと思います。 昆虫で基本的にシグナルが入ると仮定すると、それはそれで、面白いですね。

(無題) 削除/引用 No.2797-2 - 2014/02/05 (水) 14:30:42 - sugar 糖鎖修飾の違いとか関係ないですかね。 あとは、N末にプレドメインがあるけど上手く切断されていないとか。 HighFive細胞に発現させた受容体に、リガンドが結合できる事は確認できていますか。

High five細胞を用いたカルシウムアッセイ 削除/引用 No.2797-1 - 2014/02/05 (水) 12:03:30 - つん お世話になります。 バキュロウイルスを使ってHigh five細胞にある受容体を発現させ、機能解析を行っていますが、細胞内カルシウムイオン濃度の測定がうまくいかずに困っています。 目的の受容体が細胞膜上にきちんと発現していることは確認済みです。 イオノマイシン刺激すると大きなピークが観察できています。 ポジコンになりうる受容体-リガンドの組み合わせも試したのですが、応答しません。 他の細胞では、目的の受容体-リガンドの組み合わせで細胞内カルシウムイオン濃度が上昇することが確認できています。 細胞の種類によってリガンド刺激にたいする応答が異なる可能性もあるとは思いますが、原因や対策について何かアドバイスがあればお願いします。 また、自分で文献検索したかぎりではHigh five細胞でカルシウム測定しているものが見つからなかったのですが、この細胞はカルシウムアッセイに向いていないのでしょうか？ 何かご存知でしたら教えていただけませんか。

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