ご指摘ありがとうございます。心のこもった激励ありがとうございます。
> トランスジェニックマススを作るにあたり、最終的に発現を直接的（抗体）あるいは間接的(ires GFPなど）に確認できる方法を考えておかないのはどうなんでしょうか。
GFPの直後にmicroRNAの cDNAを置いてもうまく発現させることができませんでした。抗体は残念ながらありません。また、第一弾のマウスで、loxp-stop-loxp-GFP直後に、microRNA 吸着配列というシステムで比較的綺麗にワークしていたので、GFPが無くても、このシステム自体はうまくいくのではないかと考えてしまいました。
シンプルな実験を組むべきだったと反省しています。ただ、神経細胞特異的に過剰発現させたり、神経幹細胞の時点から発現させたりと少し凝ったことを考えたために、シンプルなTgマウスを作ることができませんでした。あと、研究費の縛りで実験内容を縛られてしまったという問題も加わっていました。
> 仮にDNAが入っていてもknock-inでもない限り発現が保証されることはないし、仮に発現しているとして、すべての細胞で発現するかなんかはposition effectもあるし、一度原点に返ってDNAのキットがどうこうより、その辺をどういうプランで計画された実験なのかを示した方がそれなりのアドバイスをもらえるんじゃないですか。
上記のとおりです。
> それに３ヶ月も無駄にするんならさっさとサザンをやれば白黒がつくでしょ
う。
何度もサザンのことは考えました。
そのたびに比較的きれいなバンドは出るのです。だからずるずると長く続けてしまったのですね。しかしそれが再現されない、、、。そこも問題なのです。
DNA microinjectionで作ったtransgenic mouseなら多くの場合かなりのコピー数がはいるので、エンザイムがどうこう何か言わなくてもクルードのDNAで+Taqでかかるもんでしょうし、スクリーンは数コピーに相当するプラスミドをgenomic DNAで希釈したもので、あらかじめテストしておくもので、マウスを作って３ヶ月も使って条件決めをするものではない。
それはよくわかっていますので、ご指摘ありがとうございます。
とりあえず、サザンをするなり、もし挿入しているcDNAが由来する内在性の遺伝子がイントロンを含むものであればその辺でやってみたらどうでしょうか。わざわざトランスジェニックを作るくらいだから以前に発現を見るのに使ったプライマーくらいはあるんじゃないでしょうか。
仰るとおりかもしれません。一回目のTg作成は特に問題なくワークしました。数コピー入っているのでしょう。バンドもしっかり出ました。流れ的には、
次に現在のラインのF0が生まれてきた時に頂いた、マウスのサンプルでPCRをかけたら、全く問題なくPCRがかかり、しっかりとした太いバンドが出たので、全く問題ないと考えて進みました。
が、その後、PCRがおかしくなり始めました。作成していただいた研究室からF0を送付してもらい、自分でしっぽを切ってPCRを掛けてもあまりきれいなバンドが出ないのですね。また、時折すごく太いしっかりしたバンドが出るのですね。だからなんとか条件を整えようとするのですが、あまりうまくいっているとは言いがたいですね。確かに、DNeasy+KODFxNeoは高価過ぎますね。もっと安い方法はもちろん承知しています。めい一杯急いでやるために最も良い条件で実験しようとしてしまいましたね。視野が狭くなっていたと思います。 |
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