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(無題) 削除/引用 No.2844-5 - 2014/02/23 (日) 13:00:24 - おお インサートを入れていないのと、今回の実験でひかくしてないのかなぁ。インサート入れていないもので前と活性が違うなら、DNAの劣化、トランスフェクションの効率の違い、細胞の変化、血清のロットの影響などいろいろなものが考えられます。DNAの劣化については前述しました。 活性と書いていますが、internal control で補正したあたいでしょうか、それとも生の数値でしょうか。 CMV-GFPとかCAG-GFPで導入効率を見た方が良いという意見もありますが、効率が変わっていないか調べるべきだと思います。renillaやLacZなどcotransfectionしてinternal controlとするのが基本的なやり方と思うので、internal controlの活性が落ちていたら、導入効率が落ちているといえると思いますが、、、 それでもなおかつLuc/internal controlで再現性があるなら、効率の変化は許容範囲かもしれません。もちろん昔と同じpGL3 controlをつかってのはなしです。 PGL3 controlのつもりでほかのベクター(pGL3 basic)とか使っているっていうことはないですよね。たしか制限酵素の切れ方によって判断できるとおもいますが。

(無題) 削除/引用 No.2844-4 - 2014/02/22 (土) 20:49:13 - TS ちょっと良くわからないのですけど。 新しくインサートを導入したんですよね。 何を基準に低いと言っているのでしょうか。 活性が低いプロモーターなのではないですか。前回のものよりも。 それともリファレンス用のコントロールベクターの活性が低いということ？ 遺伝子導入試薬が劣化してるとかはないですか。

(無題) 削除/引用 No.2844-3 - 2014/02/22 (土) 17:11:44 - Harmonia CMV-GFPとかCAG-GFPで導入効率を見た方が良いのではないかと。

(無題) 削除/引用 No.2844-2 - 2014/02/22 (土) 13:31:19 - おお >[Re:1] あさんは書きました : > デュアルルシフェラーゼアッセイについて教えて頂きたいと思い、投稿しました。 > > プロメガ社のpGL3 control vectorを用いているのですが、これは、どのくらいの期間保存がきくのでしょうか？ > > 3,4年前にコンピテントセルで複製させたものを使用し、新しくインサートを導入したベクターでアッセイを試みたのですが、活性値がかなり低く、古くなると活性がおちるの？と思っているところです。 ベクターに何かDNAフラグメントをいれてから3、4年たってるのですか? いずれにしろ、DNA(プラスミド)は制限酵素で切らずに電気えいどうして、スーパーコイルが大部分を占めていれば大丈夫です。ニックが入っているようであれば大腸菌に導入し直して、調製し直してください。えいどうパターンがスメアになっているときびしいですが、、、 DNA(プラスミド)は保存がちゃんとしてれば半永久的にもちます。そう言う意味では5年10年たっても大丈夫です。 入れたインサートによって、promoter活性が阻害されているということはありませんか? 通常はpGL3-basicとかpGL3-promoterとか使うと思いますが、何かねらいがあるのかな、、、それともその系では活性が弱くて持ち上げてやらないといけないとかなのかな。

ルシフェラーゼアッセイ 削除/引用 No.2844-1 - 2014/02/22 (土) 12:50:24 - あ デュアルルシフェラーゼアッセイについて教えて頂きたいと思い、投稿しました。 プロメガ社のpGL3 control vectorを用いているのですが、これは、どのくらいの期間保存がきくのでしょうか？ 3,4年前にコンピテントセルで複製させたものを使用し、新しくインサートを導入したベクターでアッセイを試みたのですが、活性値がかなり低く、古くなると活性がおちるの？と思っているところです。 新しく組み込んだインサートは、制限酵素で導入されていることを確認済み、また、ルシフェラーゼアッセイを行う際に使用する試薬も新しくしています。 知識がございましたら、少しでも教えていただけたら嬉しいです。

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