BioTechnicalフォーラム [リアルタイムPCRとRT-PCRの結果の違い]

リアルタイムPCRとRT-PCRの結果の違い

No.2847-TOPIC - 2014/02/24 (月) 15:30:29 - 学生

はじめまして、初心者です。お力を貸していただきたくてトピックを作成しました。よろしくお願いいたします。

4群のマウスで遺伝子の発現挙動を調べています。
それぞれの群をA、B、C、Dとしますと、RT-PCRではC、Dで発現量が高かったのに、リアルタイムPCRでは有意差なしという結果になってしまいました。

リアルタイムPCRとRT-PCRの解析結果は同傾向を示すものだと思っていたのですが、違う場合もあるのでしょうか。
その場合は傾向の違いに対してどのような原因などが考えられるのでしょうか。

ご存知の方はお教えください。
　

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(無題)

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No.2847-10 - 2014/02/25 (火) 20:31:55 - ふえるふえる

半定量PCRとqPCR、それぞれの増幅領域は？

もしどちらかのプライマーが、もしあるスプライシングアイソフォーム特異的にしか検出できなかったら、そういった結果になるかもしれません。

(無題)

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No.2847-9 - 2014/02/25 (火) 10:42:08 - せみ

きちんとサイクルを振って、semi-quantitativeになるようにしていますか？
コントロールがプラトーに達しているためにコントロールが揃っているように見えて、目的遺伝子に差があるように見えているだけではないですか？

(無題)

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No.2847-8 - 2014/02/25 (火) 01:55:58 - おお

最終プロダクトの配列確認は一応やった方がいいかと思いますが、簡便にやるならせめて制限酵素をつかってでも。

あまり突っ込んであれこれやっても壷にはまるだけかもしれませんので、ノーザンやるとか、転写活性や、最終プロダクトの蛋白(蛋白をコードしているのなら)をみてみるというのも手かと思いますが。もちろんいろんな制御がかかりますので、慎重に見ていく必要がありますが。

(無題)

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No.2847-7 - 2014/02/24 (月) 20:15:52 - ぴ

補足から、2種類のプライマーセットを用いているので増幅効率が違うのでは、と思います。

qPCR後のサンプルはもう飽和している状態なので、qPCR用のプライマーで普通にPCRして電気泳動するとどうなるでしょうか。それでも短い方で差がでないなら、プライマーの問題でしょう。
ただ、どちらが正しいかはこの時点ではわかりません。

あと、サイクル数はどうでしょうかね。
30サイクル前後で十分増えているでしょうか。

どちらかのプライマーで同じファミリーの遺伝子が増幅していることはないでしょうか。
Blastで確認していると思いますが、増幅産物のシークエンスを確認してもよいと思います。

(無題)

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No.2847-6 - 2014/02/24 (月) 19:44:06 - ああ

不思議ですね。

同じサンプルを用いたということでよいのでしょうか。

RT-PCRのゲルの場合は再現性は取れているのでしょうか。

qPCRでも再現性は取れているのでしょうか。バラツキはいかほどなのでしょうか。

(無題)

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No.2847-5 - 2014/02/24 (月) 17:29:43 - おお

>[Re:4] 学生さんは書きました :

>
> おおさん

> これは、最終的なintensity(RFU)がサンプルごとに違うかどうかということでしょうか？
> そういったことはなく、全サンプルで同じくらいまで増幅されています。
>
> ＞電気えいどうでエチブロなど蛍光を使って見るけいではpcr反応が飽和に達している可能性が大です。
>
> qPCRの解析は泳動したバンドの濃さで比較しているわけではないので、最終的にPCR反応が飽和に達していても問題ないと思っていたのですが違うのでしょうか？

あなたのいうRT-PCRのことです。プライまーがちがうのでqPCRの増幅曲線はあてになりませんねぇ。できるなら、qPCRのプライまーでやればどうでしょうか。でもqPCRで結果を出しているのにひつようなのかぁ。

(無題)

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No.2847-4 - 2014/02/24 (月) 17:10:05 - 学生

ぴさん
情報不足ですみませんでした。
RTに対するご指摘もその通りです。教室内で「RTとリアルタイム」と呼び分けているため語弊のある書き方になってしまいました、すみません。PCRとqPCRと言えば正しいでしょうか？

1. プライマーセットは異なるものを用いています。産物サイズはPCRでは約450bp、qPCRでは約100bpとなります。

2. qPCRの検出系はSYBR Greenです。

3. 融解曲線はきれいです。ピークは一つで全サンプル揃っており、泳動のバンドも一本で検出されました。

4. qPCR反応後の産物を泳動した結果では差が見られませんでした。

また解析方法ですが、検量線を引き、その式に閾値に達したときのサイクル数を代入して求められる値で比較しています。

おおさん
＞増幅曲線はどのようになっていますか？サンプルごとに飽和に達するときの、PCR産物の量が違うことがあります。

これは、最終的なintensity(RFU)がサンプルごとに違うかどうかということでしょうか？
そういったことはなく、全サンプルで同じくらいまで増幅されています。

＞電気えいどうでエチブロなど蛍光を使って見るけいではpcr反応が飽和に達している可能性が大です。

qPCRの解析は泳動したバンドの濃さで比較しているわけではないので、最終的にPCR反応が飽和に達していても問題ないと思っていたのですが違うのでしょうか？

(無題)

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No.2847-3 - 2014/02/24 (月) 15:52:46 - ぴ

これだと情報が少なすぎて何も答えられないのではないでしょうか。
最低限、下記の情報を追加して下さい。
どちらのPCR反応も同じcDNAを用いたとして。

1. 同じプライマーセットを用いているのか
2. qPCRの検出系はSYBR Greenかプローブ検出か（TaqManなど）
3. SYBR Greenを用いた場合、融解曲線はきれいか（泳動でバンドは1本か）
4. qPCR反応後の産物電気泳動して差がみられるか

他にもあると思いますけど、とりあえず。
ちなみに、リアルタイムPCRもRNAからcDNAを合成してPCRをかけたのならRT-PCRですよね。

(無題)

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No.2847-2 - 2014/02/24 (月) 15:40:31 - おお

リアルタイムの増幅曲線はどのようになってますか?サンプルごとに飽和に達するときの、PCR産物の量が違うことがあります。電気えいどうでエチブロなど蛍光を使って見るけいではpcr反応が飽和に達している可能性が大です。

リアルタイムPCRとRT-PCRの結果の違い

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No.2847-1 - 2014/02/24 (月) 15:30:29 - 学生

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