こんにちは。
いつも参考にさせていただいております。
本日はタイトルの実験についてご意見伺いたく、投稿させていただきました。
現在あるmiRNAの機能を明らかにする為に、培養細胞中で着目するmiRNAの量を人為的に変動させるトランスフェクション実験を試みております。
過剰発現(断片を導入)したmiRNAが細胞内でactiveになっているかを確認するため、ルシフェラーゼ遺伝子に導入miRNAが結合する3`UTR領域を含むvectorを同時にトランスフェクションしています。miRNAが細胞内でactiveになっていれば、ルシフェラーゼアッセイによる発光が抑制される仕組みです。
しかし実験を行ったところ、ルシフェラーゼアッセイでの発光は検出できるにも関わらず、miRNAの導入による発光の抑制が確認できません。
(miRNAのみが導入できていない？？)
co-transfectionの経験がお有りの方がいらっしゃいましたら、是非アドバイスをいただければ幸いです。
以下に実験方法など、状況をを記載致します。
＜材料＞
細胞: HepG2細胞
トランスフェクション試薬: Lipofectamine 2000(Invtrogen)
Vector: Synthetic miRNA Target GoClone Reporters(Active Motif社)
miRNA mimic: miScript miRNA mimics(QIAGEN)
miRNA control: AllStars Negative Control siRNA(QIAGEN)
＜群設定＞
(A) Empty vector + siRNA Control(10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM)
(B) miRNA target vector + siRNA Control(10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM)
(C) miRNA target vector + miRNA mimic(10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM)
＜具体的な操作＞
1. 96well-plateに細胞播種後、血清入り培地にて24時間培養。
2. 翌日細胞を確認。細胞密度は60〜70%
3. opti-MEMにLipofectamine2000を混合。5分間室温で静置。(以下希釈Lipo液とします)
4. siRNA Control, miRNA mimicをopti-MEMで希釈。
5. Vectorおよびsi/miRNAを希釈Lipo液に溶解。20分間室温で静置。(ここでは群ごとにチューブを用意して、それぞれ調製)
6. 細胞プレートで各wellから培地を回収。ここに5.で調製したtransfection complexを100 uL加える。
7. 24時間培養
8. 細胞溶解→発光。ルミノメーターにて計測
＜結果＞
positive controlであるEmpty vectorを含むA群では、非常に大きな発光。
miRNA target vectorを含むB, C群では、全体的に発光は減少。
B, C群を比較すると、発光量はほぼ同等。(ここで下がって欲しいのですが)
本来はinhibitorをさらに同時に加え、発光が回復する実験も行いたいです。
しかし、手始めにmimicの濃度を検討する段階でつまづいてしまいました。
transfection効率が低いのでは？とも考え、Reverse transfection法なども試してみたのですが、結果は同様でした。
何か改善点など、教えて頂けますと幸いです。
宜しくお願い致します。
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