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ありがとうございます 削除/引用 No.2858-11 - 2014/03/02 (日) 22:43:22 - JL すいません、解決済みとしたのですがお返事がまだだったので。 >まっくろんさん PCRの前後にsample volumeは目視で揃っている事は確認はしていました。 StepOneは48wellとwell数が少ないので、これ以上減らすのは避けたいところでした。 >ジャスミンティーさん なるほど励起光、検出系の劣化に傾向があるかもしれないのですね。 購入してまだ5-6年の機体ですが、劣化が既に始まっているのかも知れません。 また、この劣化はキャリブレーションで補正されるのか、メーカーに会った時に 確認したいと思います。 >よごれさん StepOneのキャリブレーションに、プレートを設置せずにおこなうという方法は 公式のものでしょうか？手元にある説明書では見つかりませんでした。 一応、backgroundのキャリブレーションは専用のプレートでおこなっています。

解決？ 削除/引用 No.2858-10 - 2014/03/02 (日) 22:32:22 - JL 皆様 いろいろとアドバイスありがとうございます。 しかし、頂いたご助言を無駄にしてしまうことになったかも... メーカーに相談する前にもう一度念のためキャリブレーションをおこなってから PCRを施行したのですが、周辺から中心に向かって増幅効率が高まるという現象は 再現されませんでした。 変わりに、定量結果のバラツキがランダムに生じるという結果となりました。 同じtemplate cDNAを希釈して、濃い場合と薄い場合で試したのですが、定量値は Ct値32cycle程度：20%程度のばらつき(Min=1.0, Max=1.2) Ct値36cycle程度；50%程度のばらつき(Min=1.0, Max=1.5) という値がほぼランダムに生じていました。 確かに以前はランダムではなく、傾向があったのですが... Ct値が36cycleで50%のばらつきは、まぁこんなものではないかと納得しています。 というわけで、原因は不明ですが現象がなくなりましたので、一応解決とさせて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.2858-9 - 2014/03/01 (土) 18:59:59 - よごれ PCRプレートを置いていない状態で撮影してみてください。 そういう校正モードがあるはずです。 きれいな状態では真っ暗な画像が得られますが ウェルが汚れているとノイズが映ります。

(無題) 削除/引用 No.2858-8 - 2014/03/01 (土) 12:40:54 - ジャスミンティー ハロゲンランプがへたってくると外側から検出感度が落ちてくるとメーカーの人から聞いたことはあります。

(無題) 削除/引用 No.2858-7 - 2014/02/28 (金) 19:10:29 - まっくろん 　使用しているプレートは96wellでしょうか？以前に，96wellで行った場合に「外側（96穴プレートで言うところのA列やH列など）は入れない方がいい」みたいな噂（？）を聞いたことがあります。シールが十分出来ず揮発のか，あるいは温度がばらつきやすいのかと思った記憶があります。本当かどうか知りませんが，それ以来，何となく嫌で96wellのぐるっと一周は使わずに行っています。PCR終了後の溶液を取ってみて，揮発等がないかwellごとに調べてみても良いかもしれません。

ありがとうございます 削除/引用 No.2858-6 - 2014/02/28 (金) 14:15:39 - JL んんさん　お返事ありがとうございます。 そうですね、色々なメーカーの機器やmaster mixの情報をみると、段階希釈系列のPCR結果を示して こんな広範囲で定量できます！という図がよくありますが、大抵Ct値が35cycle程度で増えるところ までで、それ以上の希釈系列はやっていないようです。 そして、35cycleあたりでは複数の同一サンプルの増幅曲線でも、Ct値が1cycleほどばらついている ものが多いです。 恐らく、検出限界に近いためにこのようなばらつきが生じているんでしょうね。 今回の私のケースでも、検出限界に近いcycle数ですが、ばらつきがランダムではなく プレートの周辺から中心に向かって定量値が増えるという一定の傾向があるため、 できれば原因を特定したいと考えています。

(無題) 削除/引用 No.2858-5 - 2014/02/28 (金) 10:16:05 - んん そのあたりのサイクル数だと経験的に検出限界にちかいコピー数の核酸を測定していることが多いです。

ありがとうございます 削除/引用 No.2858-4 - 2014/02/28 (金) 09:22:43 - JL hoさん、独り言さん お返事ありがとうございます。 サンプルは全well分を一括で作製（同一のエッペンチューブで丁寧にmix）して、 マルチチャンネルのピペットマンで20micro-lずつ分注しています。 分注液量は毎回チップの線のところまで吸っている事で確認して、チップへの残液も ほとんどないので、問題はないはずと考えています。 wellの蛍光、background、位置補正等のキャリブレーション等も定期的におこなっており、 問題が判明した直後にもおこないましたが、やはり改善されませんでした。 やはりメーカーに相談ですね。 というか、30cycleあたりから、このようはムラが生じるのはやはり異常なんでしょうか。 いろいろなメーカーが機器やMaser mixの紹介で、PCRの増殖曲線が広範囲にわたって揃ってます！ という図もよくみると大抵は30-35cycleあたりからばらついているので、こんなものなのかとも 思うところもあったので。

(無題) 削除/引用 No.2858-3 - 2014/02/28 (金) 02:45:52 - 独り言 まずは、機器の説明書をよんで各ウェルのカリブレーションをしましょう。 大抵、蛍光の液体をウェルに等量入れて、検出感度を同じように調節するとか。 わからない、もしくはそれでも改善しないのであれば、メーカーに相談しましょう。

(無題) 削除/引用 No.2858-2 - 2014/02/28 (金) 00:20:16 - ho サンプルの調整から書いて頂けるとアドバイスしやすいです。 多分、大丈夫だとは思いますが。 サンプル調整を度外視するとおそらく機器の問題ではないかと思います。 以前、Biorad製品で定量していた時に似たような状況になった事があります。 その時の検査ではペルチェがヘタっていたのが原因でムラになっていました。 修理後は綺麗に定量出来るようになっています。

realtime PCRのwell間バラツキ 削除/引用 No.2858-1 - 2014/02/27 (木) 23:58:32 - JL いつも参考にさせて頂いてます。 realtime PCRの増え方が、wellによってばらつきが生じてしまっています。 当方では主にTaqMan probeでおこなっていますが、全く同じサンプルを増やすと、 Ct値が30cycleをこえるようなtargetだと、均一に増えず、plate周辺より中心の方が 定量値が高くなる傾向があります。 周辺のwellに比べて、中心は1.5-3倍程度になってしまいます。 Lifetechnologies社のStepOneを純正品のMaster Mix (GeneExpression Master Mix)を用いて スタンダードモードで使用しています。 皆さんの環境ではそういった現象は起こっていないか、もし起こっているなら どのように解決しているか教えて頂けないでしょうか。 このようなばらつきが生じていない場合は、次回の機器選定の参考にしたいので、 機器とMasterMix等も教えて頂けると幸いです。

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