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結果報告 削除/引用 No.2866-10 - 2014/03/15 (土) 11:09:06 - kk １回目の実習が無事終わりました。 PCR自体はTOYOBOのQuickTaq HS DyeMixで非常に簡便にできるようになりました。 ゲノムの精製については前日に細胞を取り、私がクラシカルなフェノクロ、 エタ沈で精製することでとりあえず対処しました（苦笑 QuickTaqはすごく便利だったし、増幅もよかったので ルーチンのgenotypingにはすごくいいと思い、 実習以外の研究のほうでも使おうかなと思っています。 紹介していただきましたInstagene matrixについては購入したので 試してみてすぐできるようであれば学生にやらせたいと思います。 返事が遅れてしまいすみませんでした。 ご意見を下さった方々どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2866-9 - 2014/03/06 (木) 09:54:33 - nanashi >現在SDS入りproKで溶かした口腔粘膜細胞溶解液をそのまま >テンプレートとして使っているため、おそらくSDSが含まれていることや・・ そういう時間制限があるのでしたら バイオラッド社の InstaGene Matrixはいかがでしょうか。 あと、ニッポンジーン社からアイソヘアーという商品が新発売になっていたと思います。（すいません。こちらは使ったことがないです）

(無題) 削除/引用 No.2866-7 - 2014/03/05 (水) 22:23:22 - AP chelexあるいはそれをDNA精製に特化したInstaGeneなら、費用も比較的安く簡便なので、実習向きではないでしょうか。 SDS, ProKで粗抽出するなら、PCR反応液に加える前に10分程度90度以上に保つ(ProKを完全失活させる)、希釈する(SDS濃度をさげる)といいかもしれません。鋳型量が減ることのデメリットより、夾雑物の濃度を下げるメリットを採るほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2866-6 - 2014/03/05 (水) 21:54:49 - kk AA様 rTaqで試してみましたがだめでした。。。 nanashi様への返答にも書いてありますがゲノムが汚いのではと考えています。 一応他のTaq系の酵素が明日届くのでそれに期待します。 nanashi様 実習ということで時間制限があり、3時間程度までという制限があるので 制限酵素までは厳しそうです。 一応前日に準備という形で30〜40分確保はできるのでゲノムの精製度を 上げるほうが賢明かもしれません。 現在SDS入りproKで溶かした口腔粘膜細胞溶解液をそのまま テンプレートとして使っているため、おそらくSDSが含まれていることや 残存タンパク、RNAが多くゲノムがクルードであることがPCRがかからない 原因だと思っています。 増幅配列自体はプロモーターとかではなくエクソンですし、 130bpほどと短いので精製度が上がればうまくいくのではと思っています。 この際費用はかかりますが、スピンカラム系の抽出キットで取ったほうが 早く済みそうですね・・・。これならrTaqでもかかるかもしれません。 皆様 3'-5'exonuclease活性のないPolI系などの酵素で、 増幅効率のよいものや、スピンカラム系ゲノム抽出キットで お勧めのものがありましたらご紹介いただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2866-5 - 2014/03/05 (水) 09:12:53 - nanashi 制限酵素を使う方法ではいかがですか？ http://www.n-genetics.com/file/application_note_13_15KapaTaqEXtra.pdf

(無題) 削除/引用 No.2866-4 - 2014/03/05 (水) 01:35:01 - AA といいますか、学生実験ようなら一番安いリコンビナントのTaqで十分なのでは？ それなら校正活性も気にする必要なさそうですし。

(無題) 削除/引用 No.2866-3 - 2014/03/04 (火) 23:21:53 - kk ＡＰ様 http://www.seikei.ac.jp/university/library/st/journal/V047/JFST470205.pdf というサイトでALDH2の検出の報告があり複数の酵素を試していて その中でKOD FXを使っていたので3'-5'exonclease活性があってもいいのでは？ と希望的観測をしていましたがやはりだめなのですね。 他の酵素も試してみます。

(無題) 削除/引用 No.2866-2 - 2014/03/04 (火) 22:43:41 - AP >あと気になっているのが、上記の変異型プライマーを野生型使った場合ポリメラーゼのexonuclease活性でTが削られてCを埋め、その後ポリメラーゼが走るということはあるのでしょうか。その場合、exonuclease活性のある酵素は使えないということでいいのでしょうか。 当然のことです。

ALDH2の変異検出実験 削除/引用 No.2866-1 - 2014/03/04 (火) 22:36:45 - kk 学生実験でALDH2の変異を検出するPCRを行うべく予備実験をしています。 おおまかな実験のアウトラインはニッポンジーンのページにある方法です。 共通のforward primer：CAAATTACAGGGTCAACTGCT 野生型検出reverse：CCACACTCACAGTTTTCTCTTC 変異型検出reverse：CCACACTCACAGTTTTCTCTTT で、プログラムは 98℃1min 98℃20sec--60℃20sec--72℃30sec x35cycles 72℃3min です。 酵素はNEBのQ5を使いました（GC enhancerを使っています）。 ゲノムは口腔粘膜のスワブからproKで溶かした溶液そのままで DNA濃度は100ng/ul程度を1ul使い、total25ulの系で行いました。 結果、１０人全てへテロと出てしまいました。 確率的には低いがあり得るとも考えられますが、 おそらく野生型アリルで変異型プライマーが、 変異型アリルで野生型プライマーが 働いてしまっているのではと予想しています。 あと気になっているのが、上記の変異型プライマーを野生型使った場合 ポリメラーゼのexonuclease活性でTが削られてCを埋め、その後ポリメラーゼが 走るということはあるのでしょうか。 その場合、exonuclease活性のある酵素は使えないということでいいのでしょうか。 明日PCRの条件をより厳しくしてみるつもりですが、 なにか妙案があればと思い投稿させていただきました。

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