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(無題) 削除/引用 No.2872-13 - 2014/03/07 (金) 13:13:34 - mm ピッペトマンが汚染されている場合は、試薬を新しくしても無意味なので一度洗浄したほうがよいかもしれません。 フィルターチップでも粗悪なものもありますし、過信しすぎないほうがよいです。 メーカーによっては分解して洗浄できるので、説明書を見てみるとよいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2872-12 - 2014/03/06 (木) 20:51:25 - な PCR産物の入ったチューブを、PCRの準備もするところで開けるのは、うちでは厳禁です。 またPCR装置の温度調節が狂っていないかも調べた方がよいです。特定のウェルだけ温度が低いということも昔の装置でありました。

(無題) 削除/引用 No.2872-11 - 2014/03/06 (木) 16:26:41 - 通りすがり Pumpkinさんじゃないけど、ちょっとでも疑わしいものはすべてあたらしくするほうがいいね。 primerなんて高いものでもないし、時間を金で買うとおもって。 realtimeということでほとんど関係ないんだけど、 昔、ブルージュースにエチブロでシングルバンドに見える何かがコンタミしていた事があった、、、、

(無題) 削除/引用 No.2872-10 - 2014/03/06 (木) 15:41:58 - sei ＞Pumpkinさん なるほど、他のプライマーがコンタミしている可能性ですか。それは考え付きませんでした。 DNAのコンタミによって最適なPCR条件が変わってしまうこともあるのか？なんて考えていました。 私自身は最近は一種類のプライマーしか使用していませんでしたが、他の人が違うプライマーを使ったPCRを行ってたかもしれないので、その可能性はあると思います。 複数ピークが出るようになったこととネガでも増幅されるようになったことから、 今回は他のプライマーのコンタミと、DNAやPCR産物のコンタミが同時に起こってしまっているということになるのでしょうか。 一つずつではコンタミを繰り返してしまうことがあるのですね。 次は一気に全て新調することを教室の先生に相談してみます。 その場合、プライマーは今ある大元から新しく希釈するのではなく、大元を買い直した方がより確実でしょうか。 一か月は長いですね…できるだけ早く復帰したいものです。

(無題) 削除/引用 No.2872-9 - 2014/03/06 (木) 15:00:12 - Pumpkin まず追加質問の方ですが、ネガコンで増幅される産物があるのですから、 当然ポジコンの方でもコンタミが起きているわけで、 非特異的増幅はおきますよね？ ただ、複数ピーク出るというのが肝で、 目的産物のコンタミであれば、それだけが増幅されると思うのですが、 この場合のコンタミは目的遺伝子またはそのPCR産物でなく、 他のプライマーがコンタミしているのではないでしょうか？ 次にコンタミ源ですが、一つ一つやるとそれがまたコンタミしたかも しれないので、一気にやらなければだめです。 でも、部屋まで新調するなんていうことはしなくて大丈夫。 ピペットマンも表面をよく拭いて、 （おまじない程度にDNA AWAYとかもいいかも） フィルターチップを使えば大丈夫と思う。 最近うちの仲間がやったコンタミは、 水にPCRプロダクトがコンタミしていて、 ネガコンでもPCRがあがるってやつで、復帰に1か月かかりました。

(無題) 削除/引用 No.2872-8 - 2014/03/06 (木) 14:24:33 - sei ＞Pumpkinさん 水、チューブ、SYBR、希釈液、希釈したプライマー、チップなど、可能なものは全て新調しました。 ただ、一度に全て新しくしたのではなく、一つずつ新しくして試していって結果的にそうなったのですが…結局解決せず、お言葉通り時間を浪費することになってしまいました。 他にピペットマンや試薬調整の部屋を新しく用意するのは予算などの関係で難しいのです。 しかし、このままコンタミの起こる状況が解決しなければ、今後real-timeで定量を行うことはできないのでしょうか。

追加質問 削除/引用 No.2872-7 - 2014/03/06 (木) 14:10:43 - sei 追加で質問させてください。 最初の二回（ネガで増幅が起こらなかったとき）は、ポジコンの融解曲線のピークは1つで揃っていました。 しかし、ネガで増幅が見られるようになると同時に、ポジコンの融解曲線も複数のピークが検出されるようになりました。 PCRの温度条件は全く変えていません。 ネガでの増幅の原因がコンタミだとして、融解曲線がきれいでなくなった原因も同じくコンタミだと考えてよいのでしょうか？ それとも別の問題も存在しているのでしょうか？ ご意見ください。

(無題) 削除/引用 No.2872-6 - 2014/03/06 (木) 14:08:00 - Pumpkin ピペットマンはフィルターチップを使っていれば、 汚染源としては二の次なので、 水、チューブだけでなく、試薬を含むあらゆるものを 新調してやるべきです。 コンタミ源を探そうといろいろやる時間がもったいないので、 すべて新調した方がよいです。

(無題) 削除/引用 No.2872-5 - 2014/03/06 (木) 14:02:38 - sei 追記です。 プライマーは、大元を-30℃保存、希釈したものを-20℃保存しています。普段は後者を使っています。 チューブ、水を新しくしたのち、プライマーも新たに希釈し直しました。 チップも開封直後のフィルターチップを使用しました。 しかし結果は変わらずネガでも増幅が起こります。 ＞コンタミだと思うさん ありがとうございます。メーカーへ問い合わせてみようと思います。 エアロゾル化した核酸が原因だとしたらピペットマンやPCR調整の部屋を一新する必要があるのでしょうか。 そうだとしたら予算の関係でなかなか難しそうです。

(無題) 削除/引用 No.2872-4 - 2014/03/06 (木) 12:35:20 - コンタミだと思う フィルターチップがエアロゾル化したような核酸を通過させない保証はなかったと思います。 もし良ければメーカーに確認してみてください。

(無題) 削除/引用 No.2872-3 - 2014/03/06 (木) 12:23:11 - sei ＞コンタミだと思うさん チップは購入して開封直後のフィルターチップを用いているので、ピペットマンからのコンタミは防げているつもりでした。 しかし、やはり何かしらの経路でコンタミしているのでしょうか…。

(無題) 削除/引用 No.2872-2 - 2014/03/06 (木) 12:18:25 - コンタミだと思う ピペットマンからのコンタミの可能性はないでしょうか。

Real-time PCRでネガでも増幅が見られる 削除/引用 No.2872-1 - 2014/03/06 (木) 11:48:09 - sei Total RNA抽出、RT反応後のcDNAサンプルをテンプレートとして、Real-time PCRを行っています。 （TAKARAのSYBR Premix Ex Taq、RocheのLightCycler Nano システムを使用） 検量線作成の際、ネガとして希釈液（TAKARAのEASY Dilution）をテンプレートに用いているのですが、このネガコンでも増幅が起こってしまうようになりました。 融解曲線では複数のピークが見られます。 産物を電気泳動したところ、100〜200bpにはっきりと数本のバンドが検出されました。（うち一つは目的産物182bpかもしれません） プライマーサイズは20bpですので、プライマーダイマーでない何かが増幅されているのではと考えています。 最初の二回はネガでの増幅は見られなかったのに急にこのようなことが起こったので頭を悩ませています。 試薬などの劣化やコンタミを考えてSYBRや希釈液を新しいものに変えてみても同様に増幅されます。 似たような現象をご存じの方がいらっしゃいましたら原因、改善策などご教授頂けますようお願いいたします。

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