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もう済になっていますが、、、 削除/引用 No.2882-8 - 2014/03/13 (木) 22:21:21 - pp PCIのあとCIでフェノールを除去するのはどうかとの話ですが、 実験は違うので参考程度ですがやっています。 in situ hybriをやるための標識プローブを作るとき、 テンプレートになる制限酵素処理したプラスミドは PCI後にCIを２回繰り返してエタ沈したものを使っています。 T7やT3,SP6等のRNA polymeraseを使っていましたが 特に問題になったことはありませんでした。

クロロホルムでフェノールを除去するのは？ 削除/引用 No.2882-7 - 2014/03/12 (水) 00:33:36 - ぽん その通りだと思います。 しかしながら、ChIPの変法ですので、既報のプロトコルに従う必要があるのです。 RNaseとPK処理は必要なのです。 でも、コメントいただきありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2882-6 - 2014/03/11 (火) 21:57:58 - TK-1 > フェノクロ抽出後のDNAサンプルをエタ沈→10mM Tris-Hclで希釈→RNase I処理→proteinase K処理→カラム精製 > というプロトコルがあります。 > > これは > フェノクロ抽出→水相をRNase I処理→proteinase K処理→カラム精製 > ではいけないのでしょうか？ > エタ沈とカラム精製を両方することで収量が減ってしまうのではないかと気がかりです。 それぞれのステップが何のためにあるのかを考えれば自ずと答えが出ると思います。 1.ChIPをやったあとに最終的にカラム精製するのにRNaseで処理する必要があるか。ない。 2. RNase処理をしないのにProteinase Kで処理する必要があるか。ない。 x-ChIPなら、ビーズからeluteして、reverse-crosslink、そのままカラム精製。以上。

クロロホルムでフェノールを除去するのは？ 削除/引用 No.2882-5 - 2014/03/11 (火) 18:04:02 - ぽん 大変ありがとうございました。 フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(PCI)ではフェノールは水相に溶け込むのですね。。 ちゃんとプロトコル通りエタ沈してからRNase処理をします。 これに関係して、ちょっと考えたこと書き込ませていただきます。 クロロホルム/イソアミルアルコール(CI)処理をして、水相のフェノールを除去するとどうなるのでしょう？ それでもフェノールは残存しそうなので、プロトコルを守りますが、興味があります。

特にフェノールが水層に混入します 削除/引用 No.2882-4 - 2014/03/11 (火) 13:00:41 - 774 タイトルに書いた通り、フェノールは水に良く溶け込みますので、そのまま酵素処理をしようとしても失活してうまく行きません。 同様な操作は、例えばサブクローニングの際のPCR産物の制限酵素処理でも行います。 「PCR→フェノクロ→エタ沈→制限酵素処理→電気泳動→回収」 まれに、フェノクロを省略して制限酵素処理を行うプロトコルがありますが、これだと制限酵素により生じた付着末端が（たぶん）削られ、サブクローニングに悪影響を与えます。（バンドパターンを見るだけなら問題無いですが）

ありがとうございます。 削除/引用 No.2882-3 - 2014/03/10 (月) 22:27:37 - ぽん 具体的にはChIPのサンプルで、精製後に次世代シークエンサーに持ち込もうと考えております。 イルミナ社のChIP sample prep kitのためのサンプルです。 十分量のサンプルを得るのに20匹のマウスが必要となっているため、少しでも収率を向上させたいです。

(無題) 削除/引用 No.2882-2 - 2014/03/10 (月) 21:59:15 - Harmonia その希少サンプルは、その後どのような実験に使いますか？ 定量的なのか定性的なのか？

フェノクロ抽出⇒エタ沈⇒RNase/PK処理⇒カラム精製？ 削除/引用 No.2882-1 - 2014/03/10 (月) 21:39:20 - ぽん マウスの希少サンプルのために困っており、みなさまにご相談させていただきたく書き込みました。 フェノクロ抽出後のDNAサンプルをエタ沈→10mM Tris-Hclで希釈→RNase I処理→proteinase K処理→カラム精製 というプロトコルがあります。 これは フェノクロ抽出→水相をRNase I処理→proteinase K処理→カラム精製 ではいけないのでしょうか？ エタ沈とカラム精製を両方することで収量が減ってしまうのではないかと気がかりです。 フェノクロ後の水相がサンプルだと混入したフェノクロがRNaseやproteinase Kを失活させることを気にしているのでしょうか？ 大変申し訳ありませんが、ご指導賜れますよう、よろしくお願いします。 ＊また、キアゲンのPCR prification kitとエタ沈(glycogen(+))ではどちらのほうが収率がよいのかも、ご経験があればお聞かせください。

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