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(無題) 削除/引用 No.3284-77 - 2014/09/09 (火) 23:01:57 - ああああ すいません、追記です。 TAクローニングは以前私も行き詰ったことがあります。 結局原因は不明でしたが、TAクローニングする際のベクターを変えたら問題なくクローニング出来ました(他のサンプルは変更する前のベクターで問題なくクローニング出来ましたが)。勝手に何らかの相性?かと思っています。ご参考までにお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3284-76 - 2014/09/09 (火) 22:48:25 - ああああ 他の方も既に述べられていますが、UV照射は気を付けた方がよろしいかと。UV照射は秒数に関わらず、しない方がいいと思います。 私はクローニングする際のゲル抽は、各レーンにサンプルを流した後泳動し、マーカーおよび隣のレーンだけ切り出しEtBr、UV照射し目的のバンドを切り出します。 そして、ゲルを元通り引っ付けてUV照射していないゲルの該当する場所を切り出し、こっちをキットで抽出しています。

(無題) 削除/引用 No.3284-75 - 2014/08/26 (火) 23:21:15 - ばいあ じゃあ、in-fusionにやり方を変える！

(無題) 削除/引用 No.3284-74 - 2014/08/26 (火) 12:32:09 - おお テンプレートはプラスみどですよね。そのプラスみどにsite direct mutagenesisみたいなので制限酵素認識ぶいを作ってから切り出したらどうかと、面倒な気が向かない方法をおもいついた。。。

(無題) 削除/引用 No.3284-73 - 2014/08/26 (火) 12:28:53 - おお TAはさいしょはTaqでやっていて、PfuではふやしたものをTaqで再処理をして1ベース付加をした/するといっていました。

(無題) 削除/引用 No.3284-72 - 2014/08/26 (火) 10:58:47 - mon >[Re:63] EcoRV/BglIIさんは書きました : > はい、EtBr入りのゲルで電気泳動を行いまして、その後にUV照射で切り出しを行っております。 > 5秒ほどの照射時間です。 5秒ほどでしたら、切り出すDNA量にも寄りますがサブクローニングなら問題ないと思います....。 もっともここ数年切り出しにはCYBRSafe dyeしか使っておらず、やや自信がないです。

(無題) 削除/引用 No.3284-71 - 2014/08/26 (火) 10:21:06 - ばいや 書いてないだけかもしれませんが ベクターを切断した後T付加してますか。 Zeocinはプレカルチャーしてますか？使ったことがないから必要かどうか知らないが。 Pfu ultra IIも使ったことないので知らないが、A付加しますか？

(無題) 削除/引用 No.3284-70 - 2014/08/25 (月) 12:57:49 - おお 入れようとしているプラスミドの由来とか、PCRフラグメントの配列情報の由来とテンプレートの由来とか、いちど慎重に見直してみてもいいかもしれません。TAでも入らないのはたしかに気になりますね。。。あとUVは極力気をつけた方がいいようです(きをつけてはいるようですが)。銀紙で隠してレーンの端っこだけ当てて切り出す人もいるようです。

(無題) 削除/引用 No.3284-69 - 2014/08/25 (月) 12:51:49 - おお IDTは日本ではどうかわかりませんが、経験的にはUSではまず良好だったはず。

(無題) 削除/引用 No.3284-68 - 2014/08/25 (月) 12:48:51 - おお アダプターをつけるというのはたしかに一つのやり方ですね。あとzeocineのくせとかよくわからないのですが、もしインサートがはいった状態で大腸菌が嫌っている場合はﾊﾞｯｸｸﾞﾗﾝﾄﾞがでない最低濃度でやってもいいかもしれません。表面に塗っているということでしたら、局所的にのうどが高いかもしれませんので、前日にぬってよく拡散させてからの方がいいかもしれません。どうじにヒートショックを37度でやるとか、室温や30度でﾌﾟﾚｰﾄをincubationするとか、、、コピー数を最低限に押さえて影響を少なくする手はあります。 ほんとに大腸菌の成長に悪影響がある状態なら、二日目にコロニーがあらわれることがあります。 でも今回そのケースかわからないですね。 どうもベクターのバックグランドのでかたがきになるなぁ。精製し直した方がいいかなとまえにおもったけど、書いたかな。。。 サブクローニングの時に変なの拾っちゃったっていうことがむかし同僚がけいけんしているので(まずそう言うことは起こらないはずですが)オリジナルからふやせるといいんだが。

(無題) 削除/引用 No.3284-67 - 2014/08/25 (月) 12:30:30 - おお 最初の方からフォローしていますが、ligaseはligation後の電気えいどうで確認されてたとおもいます。ま、でもおもいきって新調してもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3284-66 - 2014/08/25 (月) 11:21:56 - cDNA 既に指摘もありますが、新調していないのは後はLigaseだけだと思います。 今回の実験の最後のEcoRV処理なしの物で飛躍的にコロニーが増えなければLigaseが死んでるということになりますが、それは試されましたか？コンピテントセルは自作のもので問題ないと思います。 キットが変わると準備するDNA断片の濃度や純度の影響の出やすさが違うという印象もあります。私はラボの人たちがTakaraのキットで問題なく出来ていたのに、ちょっとDNA濃度が低いとLigationがうまく行かない印象があって、NEBのキットではないLigaseを好んで使っています。 今回の話はキットかどうかではなく、今使っているLigaseを疑いますが、一応、補足として。 研究室が変わってUVの当て方が問題になることは時々あります。UVによるチミンダイマー生成が問題なので、ATリッチな配列を扱っていると、UVの影響が出やすくなるし、逆にGCリッチな配列を扱っているラボでは5kbpぐらいでものんびりUV当てながら切っても問題ないので感覚が全く違います。

(無題) 削除/引用 No.3284-65 - 2014/08/25 (月) 09:14:46 - おお なんか見落としてないですかね。。。PCRのフラグメントの内部の配列にEcoRVがあるとか。もし配列をそのプラスみどからよんだものでなくって、データーベースから引っ張ったものだったら、微妙に違うかもしれません。。。

(無題) 削除/引用 No.3284-64 - 2014/08/25 (月) 08:52:19 - とり 結構多いのでフォローしきれていないのですが、PCRのテンプレートがplasmidであるということで、その遺伝子自体が大腸菌の発育に問題があるというわけではないようですね。 問題のある部分をひとつひとつ検証するのが時間はかかりますが確実だと思うのですが、ひとまずligaseの活性があることは確認されていますか？ ラボの他のメンバーが他のコンストラクトで問題なくできているとか、あとは自身で制限酵素の切り貼りでもよいので問題なく挿入できるか確認はされているでしょうか。 すこしアプローチを変えて、どうしても出来ない場合は元のプラスミドの目的部分の両端に対して、制限酵素サイトを塩基置換かリンカーの挿入で導入し、導入した制限酵素で切断した後に目的のベクターにいれる、という方法もとれると思います。 ligaseに問題がなければ、PCR産物の制限酵素の切れ残りとか、平滑末端のligation効率の低さやTAクローニング時のA付加など考えなくてよいので、こちらの方がやりやすいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3284-63 - 2014/08/25 (月) 06:47:26 - EcoRV/BglII monさん 早速にコメントいただきまして、誠にありがとうございます。 はい、EtBr入りのゲルで電気泳動を行いまして、その後にUV照射で切り出しを行っております。 5秒ほどの照射時間です。 XCとBPB入りのdyeで泳動を行うと、目的のバンドはXC（400bp？）のところと重なりますので、サンプルを直接UV照射する理由は特段ありません… これまでのlabではそのように行っていましたので、疑いもしませんでした。 ちなみにUV照射機器は（前のlabのものよりは）古いものでした。これによってTAクローニングができなくなる可能性になりますでしょうか？ 避けられる原因は捨て去りたいです。すみませんが、どれほど影響しうるのか決定的と言えるほどのものなのか感覚的なことで構いませんのでまたコメントいただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3284-62 - 2014/08/25 (月) 06:22:01 - mon もしかして、ゲルから切り出すときは、EtBr染色+UV照射ですか？ 最近のUVランプは感度をあげるために短波長のものが多く、DNAへのダメージが強いですよ。

(無題) 削除/引用 No.3284-61 - 2014/08/25 (月) 05:02:47 - EcoRV/BglII こんなこともあろうかと、別のplasmid backboneに挿入できるようなプライマーセットも注文しておいたんですが、それで行ってもできる気がしません。それも同じようなストラテジーで、kugation後にEcoRVで切って目的のligation産物を濃縮するという方法です。 ただこれで行っても、上手く行く気がせず、TAクローニングでさえ上手く行かないというのは信じられないです。何か根本から間違っていると考えた方が良さそうなんですが、それが全くわかりません…

(無題) 削除/引用 No.3284-60 - 2014/08/25 (月) 04:37:38 - EcoRV/BglII おおさん 返信が大変遅れましたこと申し訳ありません。 早速行ってみましたが、コロニーゼロでした。 手順は以下の通りです。 1-興味ある遺伝子が既に挿入されたplasmidをテンプレートに、Pfu ultra IIでPCR。 2-電気泳動にてシングルバンドを確認しつつ、予想される分子量のバンドをゲルから切り出し、精製 3-精製されたことを電気泳動にて確認。 4-同時並行で挿入したいplasmid backboneをEcoRVで2時間, 37℃でcut 5-電気泳動にて、plasmid backboneをEcoRVで切ったもの、切っていないもので比較し、EcoRVがきちんと働いている事をplasmid backboneの移動度の違いにより判定 6-EcoRV処理したplasmid backboneをQia Quick spin colomnで精製 7-plasmid backbone : insert = 1:3でligation, 4℃冷蔵庫, 24 hrs. 8-ligationサンプルの入ったチューブを室温で5 minほど放置 9-Qia Quick spin colomnで精製（ligaseを除くため） 10-EcoRVを加え、1時間, 37℃でcut（未消化plasmid backboneを完全に切断するため） 11-DH5alphaに形質転換 12-Zeocinにて薬剤選択 13-オーバーナイト, 37℃でコロニーゼロでした。 ＊今回、DH5alphaの残量が限られていたため、negacon（insert無しのもの）は行いませんでした。 もう何がなんだかさっぱりです。DH5alphaのコンピテンシーは自作ではあるものの、10^8はあるものを使いました。workすることは確認済みです。ラボを変えて以降一度もクローニングに成功していません。PCRは上手くいっていそうなのに、TAクローニングでさえ上手く行かないこと、プライマーを大幅に変えてもうまくいかないことなどから精神が疲弊してきそうです。 今回は他の方からの質問があったようなリン酸化、脱リン酸化などは考えずに行っています。 プライマーはIDTというところから購入しました。前のラボではsigmaでした。

(無題) 削除/引用 No.3284-59 - 2014/08/23 (土) 11:47:19 - おお あ、そうだtaqが弱っているかもしれないってまえにかいたけど、そのtaqでPFUのあとAをつけようとしていたとしたら、、、

(無題) 削除/引用 No.3284-58 - 2014/08/23 (土) 11:03:08 - おお へえ。。。わたしは極力ゲルから回収する派だなぁ。。。 PCR産物なんで見えないけど、クローニングで邪魔するレベルの副産物がけっこうあるような気がして怖い。 長いPCRフラグメントだと、そう言う副産物の方が有利で思ったものがなかなか取れないんじゃないかと思ってします。

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