おおさん monさん
できるだけ総取り替えを行いました。
まず水、PCR buffer, Taq (Qiagen Taq polymerase), dNTPs, コンピテントセルを新しいものにしました。
PCRのテンプレートは、目的の遺伝子が既に入ったプラスミドを用いています。
PCR後、目的の400 bpのbandをゲルから切り出し、その後精製されたかどうかを電気泳動でチェックしました。
その後、TA cloning （salt 0.5 ul, PCR産物 2 ul, TA vector 0.5 ul）を室温2 hrs行い、全量を新しいDH5α（コマーシャルなものです。非常に貴重でもうこれ以上コマーシャルなものを使わせてもらえなさそうでした。）
X-galを塗ったAmpicillin含有LBプレートにヒートショック（その後2 min氷上冷却）した大腸菌を1 hr SOC培地で37˚C震盪培養後プレーティングしました。
翌日、かなり多く50個ほどのコロニーを確認しました。ホワイトが8個、残りがブルーでした。
コロニーPCRを行おうと、TAキット付属のM13リバースプライマーとM13フォワード(-20)プライマーを用いてコロニーをつついてPCR反応を行いました。
結果は全てにおいて200 bpほどのシングルバンドが（35サイクルにしてはうっすらと）検出されました。（コロニーPCRでは白8個、青8個の大腸菌、ネガコンとして水を行いました。）
200 bpのバンドということは、400 bpのインサートが入っていないということです。
TAキットも新しいものでした。
過去のトピックで「コロニーPCRは信用出来ない」とありましたので、今2 ml培養液で震盪培養しています。その後miniprepして、EcoR1でカットしてinsertが切り出されるかやってみようと思いますが、望み薄でしょうか？コロニーPCRで200 bpで入っていなさそうですよね？
ちょっとしんどくなってきました。。 |
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