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(無題) 削除/引用 No.3364-19 - 2014/09/11 (木) 06:41:06 - mon >[Re:16] 大学院生さんは書きました : > monさま > (1)ですとラダー上にプロダクトができそうなので、(2)が良さそうでしょうか？ どうせOligoDNAは余るし温度条件等は同じなので、(1)-(3)同時に試して綺麗に増幅したモノを採用しています。

(無題) 削除/引用 No.3364-18 - 2014/09/11 (木) 01:27:48 - ４ピース 45bpくらいのforwardとreverseを合成してアニール、真ん中のオリゴをリン酸化して、ベクターと４ピースライゲーション、という方法もあるにはありますよ。PNKが冷凍庫に転がってれば試す価値あり。

(無題) 削除/引用 No.3364-17 - 2014/09/11 (木) 00:10:29 - AP >PCR酵素でもエラーが入るので当然と言われればそうなのかもしれませんが、 つい盲目的に信じてしまいそうになります。気をつけたいと思います。 1塩基あたりのエラー頻度は校正活性のあるポリメラーゼで10^-6オーダー程度、校正活性のないTaqでも10^-4オーダーと言われています。固相合成法では10^-2オーダーですから桁違いと言えましょう。

(無題) 削除/引用 No.3364-16 - 2014/09/10 (水) 23:52:57 - 大学院生 sevenさま ありがとうございます。 実は増やしたい配列はCre酵素の組換で使う、FLEX配列(loxP-loxP2272配列)で、 一応鋳型になりそうなDNA(プラスミド)もあるのですが、 上流側と下流側がとても似ているので普通のPCRでは増やせないのでは無いかと考えていました。 monさま なるほど、プライマーなので2本という固定概念にとらわれておりました。 目からうろこです。 4本に分ければ確かに安い価格帯で買えるので嬉しいです。 細かい組み合わせまでご教示いただいてありがとうございます。 (1)ですとラダー上にプロダクトができそうなので、(2)が良さそうでしょうか？ もんさま 合成遺伝子は不勉強で考えにありませんでした。 確かに2万円程度でできるなら、長いオリゴDNAを頼むより確実ですね。 APさま ありがとうございます。 人工的に合成する場合はどうしてもエラーが入ってしまうのですね。 PCR酵素でもエラーが入るので当然と言われればそうなのかもしれませんが、 つい盲目的に信じてしまいそうになります。気をつけたいと思います。 短めのほうがよいのであればmonさまのご指摘のような方法が良いのでしょうか？ プライマー濃度も、確かに普段のPCRでも短いバンドができるので あまり気にせずやってみたいと思います。 下手な策は弄せず、まずは基本に忠実に頑張りたいと思います

(無題) 削除/引用 No.3364-15 - 2014/09/10 (水) 17:32:00 - AP なんだか「策士策に溺れる」という言葉が頭に浮かびました。

(無題) 削除/引用 No.3364-14 - 2014/09/10 (水) 17:25:11 - AP それだけ長い鎖なら、全長の相補鎖を合成してアニールさせる方法はおすすめできない。3'末端同士だけアニールする相補鎖で欠落部分を酵素で合成する場合でも、あまり長くならないほうがいい。 過去トピでもなんどか論議されていますけれど、 年々技術が向上しているとはいえ、DNAを固相合成するときの仕様で、どうしても一ヌクレオチド伸張するごとに数%だかのエラーが生じます。長く合成すればするほどパーフェクトな配列を保持した分子の割合は減っていきます。 つまり、合成DNAがある程度以上(目安として50 ntくらい以上）長くなると、 ・配列のエラーが増える。 ・エラーのうち、鎖長が足りない分子を除くためにPAGE精製など、コストがかかる精製が必要となる。 ・上記のような精製で歩留まりが悪くなるので、アウトプットに比べ、合成スケールを大きく取らないとならない。ここでも余分にコストがかかる。 なので、どうしてもその方法を取らざるを得ない時以外は,わざわざやって得することはなにもないです。 >普通のPCRでも問題ないのでは？ これに尽きます。 以上のように、方法としてはおすすめしないのですが、一応、 >重複させる配列の長さはどの程度が適切なのでしょうか？ >ちなみにPCRの際のプライマー濃度はどの程度が適切なのでしょうか？ 適当でいいんですが、要はわざとプライマーダイマーを作らせようっていうことです。プライマーダイマーは3'末端が3-4nt相補なだけで、普通のPCR反応の条件でバッチリできます。私見では10ntも相補にしておけば十分じゃないでしょうか。

100bpくらいなら 削除/引用 No.3364-13 - 2014/09/10 (水) 17:03:16 - もん 受託の人工遺伝子合成で作った方が確実だし手軽だと思う。 ２万円くらいでできるのでは？

(無題) 削除/引用 No.3364-12 - 2014/09/10 (水) 16:58:58 - mon 2本に拘らず、3-4本に分割すれば良いですよ。10本ほどを組み合わせたこともあります。 低価格で合成してもらえる最長の長さ（メーカーによるが50~70merくらい？）で、20bpほどのオーバーラップで合成します。 オリゴ濃度は0.5-1uMを汎用しています。 4種オリゴを順にA,B,C,Dとすると（B,Dは逆向き）方法としては良く行うのは、 (1)全部混合(A,D 1uM, B,C 0.01uM)したPCR (2)全部混合(すべて1uM)したPCR、その産物1/50量を鋳型にA,Dで再度PCR (3)近場同士（A+B, C+D）で一回目PCR、産物（A/B, C/D)を1/50量ほど混合し、両端のOligo（A,D)でPCR 場合によってはゲルから切り出して、クローン化。

(無題) 削除/引用 No.3364-9 - 2014/09/10 (水) 16:06:21 - seven 値段との兼ね合いですが、普通のPCRでも問題ないのでは？ インサートが内在配列でない場合は合成でつくるのが確実だとおもいますが。

(無題) 削除/引用 No.3364-8 - 2014/09/10 (水) 15:28:14 - 大学院生 おおさま ありがとうございます。 余裕を見て20bpくらいあれば安心というところでしょうか。 片側80merくらいとなると、合成オリゴメーカーのHPで見る限り 結構なお値段になりそうでドキドキします。。。 ちなみにPCRの際のプライマー濃度はどの程度が適切なのでしょうか？ 普通のPCRは0.5pmol/マイクロリットルとなるようにしていますが、 プライマーが鋳型を兼ねる場合はもっと濃いほうが良いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3364-6 - 2014/09/10 (水) 14:55:51 - おお だいたい16b重なっていれば何とかなるようですが、もうちょっと長くてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3364-5 - 2014/09/10 (水) 14:50:11 - 大学院生 たびたびすみません。 このような互い違いになっているプライマーを設計する場合、 重複させる配列の長さはどの程度が適切なのでしょうか？ 作りたい配列は、132bpでGC%は37%、両端に制限酵素サイトを付けたいので、 プラス20bpでプロダクトの全長は152bpと言った感じになります。

(無題) 削除/引用 No.3364-4 - 2014/09/10 (水) 14:43:29 - 大学院生 TSさま ご指摘ありがとうございます。 コストということで調べてみたのですが、 100bpを超えると1塩基あたり100円を超えてきてしまうようで、 1プライマーで1万円以上の値段になってしまいますが、 これは普通なのでしょうか？ 以前に頼んだPCRプライマーは1000円くらいだったので尻込みしてしまいます。。 おおさま どちらでも作れるということでご指摘ありがとうございます。 PCRサイクルのほうが収率が良さそうということなので、 まずそちらでためしてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3364-3 - 2014/09/10 (水) 14:20:05 - おお >[Re:1] 大学院生さんは書きました : > この場合、PCRはステップを繰り返すプログラムにするのか、 > はじめにアニーリングしたら後は、 > RT-PCRの時のように同じ温度で長時間反応させるのか > どちらが良いでしょうか？ 両方のやり方があります。特に一定温度でやるほうほうは、PCRがあまりポピュラーでなかった頃からある方法で、T4 DNA polなどをつかってやられていました。 PCR enzymeをつかってサイクル数を稼ぐ方が、特異的反応してくれれば効率がかなり高くなるとはいえるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3364-2 - 2014/09/10 (水) 14:03:56 - TS 100bp程度であれば、少しだけコスト高にはなると思いますが、 「あいうえお」のFとRを注文して、アニーリングすれば簡単です。

プライマーだけのPCR 削除/引用 No.3364-1 - 2014/09/10 (水) 13:29:26 - 大学院生 いつも勉強させていただいております。 クローニングに使うフラグメントをPCRで増やしたいのですが、 フラグメント長が100bp程度しかないので、 プライマーだけでPCRすればいいんじゃないのかと同級生に言われました。 「あいう」 　　　と 　　「うえお」 をアニーリングして「あいうえお」を作る感じだと言われたのですが、 この場合、PCRはステップを繰り返すプログラムにするのか、 はじめにアニーリングしたら後は、 RT-PCRの時のように同じ温度で長時間反応させるのか どちらが良いでしょうか？

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