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(無題) 削除/引用 No.3465-14 - 2014/10/22 (水) 23:58:39 - おお >セレクションマーカーをつかって数日培養して セルソーティングでなくって、薬剤耐性を使うっていうことでした。 Just in case

(無題) 削除/引用 No.3465-13 - 2014/10/22 (水) 21:06:01 - CHO コメント、ありがとうございます。 ~さん、 いくつかのタンパク質を哺乳類の細胞から採取して、実験に使いたいため、293かCHOに発現させようとしています。CHOのほうが多くのタンパクを取れるよと聞いていたので、試してみたのですが、このTransfection効率のところでまずひっかっかっています。これが一般的なことなら、293に戻るのですが、もしかすると何らかの手技の問題ではと言うことで、皆さんにお伺いさせていただいています。 monさん、 情報ありがとうございます。 Lifetechに聞いてみたいと思います。 おおさん、 ソーティングも考えているのですが、なにぶんこれほどまで入らないと思っていませんでしたので、本当にそうなのか、まずはそこをクリアーにしたいと思っています。 Transfectionの際はRPMI、血清入りを使っています。 無血清培地を使ってみたのですが、それほど効果的ではなかったため、それ以降血清培地を使っています。 ｋさん、 ご指摘ありがとうございます。 今は48Wellの系で試しているところです。 Lipofectamine2000では前日に細胞をまいて、次の日は80-90％Confluencyです。 25ul Opti-MEMIにPlasmidを0.5ug入れます。 同じく25ul Opti-MEMIに1ul Lipofectamine2000を入れて、5分間待ちます。 それぞれのMixtureを混ぜて、さらに20分待ちます。 それをCHOに加えて、3日後にHarvestします。 評価はGFPの蛍光を顕微鏡で見るのと、さらにCell lysateをMicroplate readerでGFPのIntensityを計りました。目的タンパク質はWesternでみています。結果は断然Lipofectamineがよく、次にX-treme>TransPass=jetPRIME>FugeneHD、そしてもっともひどかったのがTransIT-CHOでした。

(無題) 削除/引用 No.3465-12 - 2014/10/22 (水) 17:51:25 - k 20-30%でも相当低いですね。 そもそもLipofectamine 2000の品質評価はCHO-K1細胞を用いているので入らないはずはないのです。 トランスフェクション時の培地の血清、抗生物質などが問題になることもありますが、経験上抗生物質が入っていてもそれほど問題に感じた事はないです。 試薬の量よりも、DNAの量を増やした方が導入効率は高くなる印象です。 それに併せて試薬の量も増やしますが、DNA量が増えると毒性も高くなるので注意が必要です。 一度、96-wellか24-wellでDNAの量と試薬の比率を多数振ってみて、最適な条件を見つける必要がありそうです。 可能であれば実際に行ったプロトコールを記載すると、見落としていた問題点を誰かが指摘してくれるかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.3465-11 - 2014/10/22 (水) 17:34:36 - おお セレクションマーカーをつかって数日培養して(stableをとるのでなくって)、入っている細胞を濃縮して実験するというのをきいたことがあります。どの程度うまくいくかは、、、わからないですが、、、 血清を下げるほうが効率がいいとはききますが、transfectionのときの培地はどうしているのでしょうか。無血清や低血清、あるいはopti-MEMなどつかうプロとコールもあるので、、、

(無題) 削除/引用 No.3465-10 - 2014/10/22 (水) 12:10:10 - mon 使ったことはないですが、lipofectamine-3000も良いようですよ。 サンプルももらえるようです。 http://www.lifetechnologies.com/jp/ja/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-3000.html 試された際には結果を報告していただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3465-9 - 2014/10/22 (水) 09:49:23 - ~ 20~30%入れば、セレクションマーカーを付けてマスカルチャーやクローニングもできると思いますが、 トランスフェクション効率が重要な実験系なのでしょうか？ 先にマスカルチャーであたりを付け、あわよくばそのデータでまとめてしまうというのも手だと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3465-8 - 2014/10/22 (水) 00:03:22 - CHO qwさん、 CHOがDMEMでだめだったとは知らなかったです。 今はRPMIで培養していて、Growthに関しては問題なさそうです。 サンショウウオさん、 コメントありがとうございます。 このGFPはpEGFPベクターを使っています。 最近Lipofectamineを多めに使って、20-30％にまであげることができましたが（一回しか試していませんが）、実験に使うにはもう少しあげたいところです。 もう少し試してみます。

(無題) 削除/引用 No.3465-7 - 2014/10/21 (火) 14:29:58 - サンショウウオ 目的タンパク質の翻訳効率かな？と思ったけどGFPは293で発現しているようだし。 人とハムスターのコドンの使用頻度ってそんなに違わないだろうからコドン最適化までする必要ないよなぁ。。。と。。。

(無題) 削除/引用 No.3465-6 - 2014/10/18 (土) 11:11:50 - qw CHOのtransfectionは最近全く使っていませんが、最初、DMEMでもいけるだろうと思って、失敗したことがあります。 CHOはPro合成欠損なのですが、使う培地は大丈夫ですよね？ もしかするとTransfection用の培地にも注意が必要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3465-5 - 2014/10/17 (金) 20:15:18 - CHO コメントをいただき、ありがとうございます。 私も入りやすいと聞いていたので、試しているのですが、予想と違って戸惑っています。 Transfection効率はGFPと目的タンパク質のWesternで見ました。 GFPでは10％ぐらいが光っているのが分かりましたが、目的タンパク質のWesternですと、うっすらバンドが出るぐらいです。 同じPlasmidを293に入れると、GFPは80％ぐらい、Westernでは目的タンパク質のバンドがくっきりと確認できます。 PlasmidはMaxiの後にフェノクロをしているので、かなりきれいだと思います。このPlasmidは293には問題なく入ります。 CHO-K1は購入してすぐに使っていますのでEearly passageだと思っています。 293と比べていることと、期待しすぎていることが問題なのかもしれませんが。 ちなみにReverse transfectionも試みたのですが、こちらはさらに入らなくなってしまいました。 もう少し条件検討を行ってみます。

(無題) 削除/引用 No.3465-4 - 2014/10/17 (金) 18:42:35 - ~ もう10年以上昔ですが、CHO-K1にはリン酸カルシウム法で入れていました。 まずは購入元に状況を説明し、コメントを貰ってみてはいかがでしょうか。 購入した株自体に問題があれば、こちらでできることはほとんどありません。せいぜい、そこからサブクローンをたくさん取り、トランスフェクション効率が高いサブクローンを選ぶくらいことくらいでしょうか。 また、同じプラスミドを他の細胞株に入れることはできるのでしょうか？ プラスミドが汚いためにトランスフェクション効率が悪いというのは、昔はよくありました。 精製キットを使うようになってからは、そんな話はほとんど聞きませんが。

(無題) 削除/引用 No.3465-3 - 2014/10/17 (金) 16:47:47 - おお 元祖リポフェクタミンでもかなり入るような印象がありますけど、、、あとはPEIとかリン酸カルシウム法でもいけそうな気がします。。。 細胞が長期けいだいされていて性質が変わってしまっているとか、試薬よりもほかのところに問題があるような気がします。。。

(無題) 削除/引用 No.3465-2 - 2014/10/17 (金) 09:02:22 - k CHO-K1細胞は遺伝子が入りやすい細胞だと思うのですが。 LipofectamineやPLUS試薬で高い効率で導入していました。 まったく入らないというのは、GFPなどのコントロールプラスミドも入らないということですかね？ それとも細胞毒性が高いとかでしょうか。 プロトコールに何か問題があるように思いますが、DNAと試薬の比率や量を変えてもだめですか？

いいCHO cell transfection reagentはないでしょうか？ 削除/引用 No.3465-1 - 2014/10/17 (金) 08:14:34 - CHO 現在、CHO-K1細胞へのPlasmid transfectionを試みています。 購入したばかりのCHO-K1を使って、Mirus のTransITを使ったのですが、まったくはいらなくて、他の細胞でよく使っていたFugenHDやLipofectAmine 2000でもなかなか入らなくて困っています。 もしCHO細胞へのTransfectionを行っている方がいましたらぜひ教えてください。 ちなみにElectroporationは試みていませんが、予算的にTransfection reagentをまず試してみたいです。 よろしくお願いいたします。

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