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(無題) 削除/引用 No.3472-10 - 2014/11/01 (土) 15:23:10 - 脂肪 すみません、何時間という単位ではないです。 確か３〜５日くらいだったと記憶しております。 チアゾリジン誘導体刺激数時間で上がってくるような遺伝子はちょっと調べてないです。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3472-9 - 2014/10/29 (水) 17:38:01 - あおぞら 脂肪　さん ありがとうございます！！ 何時間ぐらいの処理で、mRNA発現はあがりましたでしょうか。 今回のGW9662がうまくワークしなかった答えの論文をみつけました。 GW9662 のhalf lifeがすごく短い（２h）ということを示していました。 J Steroid Biochem Mol Biol. 2011 Oct;127(1-2):9-15. doi: 10.1016 みなさま、ありがとうございました。再度計画を練り直してみます。

(無題) 削除/引用 No.3472-8 - 2014/10/28 (火) 19:04:26 - 脂肪 チアゾリジン誘導体を3T3-L1に処理すると、褐色脂肪細胞系の遺伝子群（UCP1など）の発現が上がった記憶があります。

(無題) 削除/引用 No.3472-7 - 2014/10/23 (木) 23:18:26 - おお >[Re:6] あおぞらさんは書きました : > おおさん > 　ありがとうございます。 > ＞でよくわからないのですがどれとどれを比べてPPARγが動いた動かないとしてるんでしょうか。。。処理前、処理後の比較か、処理後で各処理の比較か、、 > Troのみで処理した群と、TRO＋GW9662で処理した群です。 両処理群、TRO添加時点、添加後ではどうでしょうか?TRO添加時点でベースラインがすでに変わってるかもしれません。 > たら、TROによるPPARγやSCD1発現抑制を明確にPPARγdependentであることをしめす論文、ないですね。 > 　コントロールとする直接的ターゲット遺伝子を再検討すべきということですね。。。 目的が何かにもよりますが、作用機構が分からないと何を見ているかよくわからなくなる可能性があるので、、、たとえば内因性リガンドなどでもその変化は起こりますか?ほかのアンタゴニストでどうなるかも興味があるところです。従来の転写を介しているのかとか転写以外に作用があるのかとかいう可能性も含めて。 他の遺伝子を試すのであればcDNAを作成していれば、それに関してはプライまーをかえるだけでいいですね。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3472-6 - 2014/10/23 (木) 21:38:50 - あおぞら おおさん 　ありがとうございます。 ＞でよくわからないのですがどれとどれを比べてPPARγが動いた動かないとしてるんでしょうか。。。処理前、処理後の比較か、処理後で各処理の比較か、、 Troのみで処理した群と、TRO＋GW9662で処理した群です。TROのみで処理するとPPARγやSCD1のmRNA発現が低下します。これは既報です。TROがPPARγのアゴニストですので、これらの作用はPPARγdependentだと考えておりました。そのため、TRO+GW9662処理群では、mRNAの発現低下が相殺される、と予測していたところ、有意な効果がない、結果となったわけです。 たら、TROによるPPARγやSCD1発現抑制を明確にPPARγdependentであることをしめす論文、ないですね。 　コントロールとする直接的ターゲット遺伝子を再検討すべきということですね。。。

(無題) 削除/引用 No.3472-5 - 2014/10/23 (木) 08:54:00 - おお PPARγはライガンド依存的に転写を活性化するので、その直積的なターゲットの遺伝子変化を見たらいいかと思いますが、あるいはそう言う転写活性をみるreporter plasmidもあるようですし。、、、そうするとやはりPPARγのdownregulationはPPARγが自身のプロモーターに作用する直接的なものなのかどうか、、、 直接的なさようであれば48時間はいらないかもしれませんね。 でよくわからないのですがどれとどれを比べてPPARγが動いた動かないとしてるんでしょうか。。。処理前、処理後の比較か、処理後で各処理の比較か、、、

ありがとうございます。 削除/引用 No.3472-4 - 2014/10/22 (水) 08:57:45 - あおぞら alphaさん 　貴重なご指摘をありがとうございます。　　48時間の実験系がいくつかありましたのでこの時間を採用しておりました。短い時間でもやってみます。 Vosさん 　もっとも大切な点ですね。ちがう遺伝子で確認してみます。

(無題) 削除/引用 No.3472-3 - 2014/10/21 (火) 15:06:11 - Vos troglitazoneによるPPARγのダウンレギュレーションがPPARγ-dependentであることは確かですか？？

(無題) 削除/引用 No.3472-2 - 2014/10/21 (火) 14:41:19 - alpha 48時間も阻害剤が作用していないのでは？

PPARγ阻害剤での実験 削除/引用 No.3472-1 - 2014/10/21 (火) 13:43:31 - あおぞら いつも参考にさせていただいています。 初歩的な質問ですみません。 GW9662を使用した阻害実験が上手く行かなくて困っています。 現在、脂肪細胞3T3-L1に、ある刺激による遺伝子の発現変化を解析しています。 PPARγを介した経路かどうかを確認するために、PPARγ阻害剤であるGW9662を使用した系で検討しようとしているのですが、GW9662が上手く効かないようで困っています。 実験方法は以下です。 脂肪細胞　分化誘導より７日目　に　ポジティブコントロールとしてTroglitazone（PPARγアゴニスト）　（１−１０μM）で添加。GW9662は５−５０μMで、Troglitazone添加の２時間前に添加。処理の48時間後に回収。TroglitazoneはPPARγ遺伝子発現を低下させることが判っているので、TroglitazoneによるPPARγの遺伝子発現の低下がGW9662で相殺されることをコントロール実験としていますが、まったくGW9662の効果が認められません。 GW9662はエタノール　(100%)で10mMの濃度にとかしたものを分注してストックとして-20℃に保存し、使用しています。ストックを作成したのはつい１週間前です。 なにか初歩的な理解の誤りがあるのでしょうか。 コメントをいただけると嬉しいです。

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