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(無題) 削除/引用 No.3511-15 - 2014/11/06 (木) 11:21:48 - おお いろいろほかにも問題があるかもしれませんけど、オリゴが多すぎて環状ライゲーションの効率が落ちてるかも。インサートのオリゴの量を振ってみてはどうでしょうか。ベクターに対して100倍とかになるとガクンとコロニーの数が減ることがあります。

(無題) 削除/引用 No.3511-14 - 2014/11/06 (木) 10:42:16 - AP >ベクターはmidiprep下もの1ugをXba1, Not1 in buffer 3+BSAで２時間, 37℃処理したものをQIA Quick spin colomnで精製したものです。 Hgh buffではXbaIの活性がかなり低くなるので、私はやりませんが（XbaI@M→NotI@Hで順次消化）。まあ、それは原因ではないでしょうけど。 ゲル切り出しはしていないわけですよね。 だったら、全く消化されなかった環状プラスミドや、片方しか切れていなくてセルフライゲーションしたやつが生えてきそうなんですが、それすら出てこなかったってことですよね。

(無題) 削除/引用 No.3511-13 - 2014/11/05 (水) 23:46:06 - 横から 中年様 ご指摘ありがとうございます。言葉の使用を誤っておりご指摘ありがとうございます。 はい、TA+NaClはannealingの時のみで、その後のligationはTEで希釈したものを使用しています。 ですが、その希釈倍率はかなり低い5倍とかです。。 ので、今後、もっと高濃度でannealingを行った後、大きく希釈してligationしてみます。 NaClがT4 ligaseを阻害するとは知りませんでした。大変重要な事を教えていただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3511-12 - 2014/11/05 (水) 23:43:27 - 横から すみません。Not1とXho1ではなく、Not1とXba1でした。以下がそのシークエンスです。 これで大丈夫だとは思うのですが。。 Not1-FLAG-STOP-Xba1#F (40 nt) 5’- GGCCGCGGAGGCGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAGT -3’ Not1-FLAG-STOP-Xba1#R (40 nt) 5’- CTAGACTACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCGCCTCCGC -3’ Tany様 挿入したい配列は40 ntほどの長さですので、TAクローニング後の切り出し精製で上手く行かないかもとのおそれがあり、今回このような方法を行いました。ゲルから抽出精製の際のスピンカラムでは40 ntはパススルーに来てしまいますよね？ AP様 >オリゴDNAがアニールするとXhoIとNotIの付着末端ができて、それをそれらの酵素で二重消化したベクターに入れるという操作だという理解でよいでしょうか。 はい、その通りです。言葉足らず申し訳ありません。 >ベクターはどのように調製されたものなんでしょうか。 ベクターはmidiprep下もの1ugをXba1, Not1 in buffer 3+BSAで２時間, 37℃処理したものをQIA Quick spin colomnで精製したものです。いつもこのように調製していました。20 ul EB bufferで溶出後、そのうち1 ulをligation (50 ng分)をligationに用いました。

(無題) 削除/引用 No.3511-11 - 2014/11/05 (水) 16:26:36 - 中年 No.3511-10の「長いオリゴは効果だし」は「長いオリゴは高価だし」の間違いです。

(無題) 削除/引用 No.3511-10 - 2014/11/05 (水) 16:25:04 - 中年 横からさん、 プライマーの希釈にTE+NaClを使っているとのことですが、これはアニーリングの時の話で、その後の希釈にはTEをお使いですよね。NaClはT4リガーゼを邪魔するので、ライゲーション反応への持ち込みを少なくした方が効率が良いですよ。PEGを含んだようなライゲーション反応液だと問題ないのかな？ また、お書きになっているのはオリゴヌクレオチドのアニーリングで、プライマーダイマーにはなっていませんよね。プライマーダイマーというのは、２本のオリゴが3'末端側でアニーリングして、お互いを鋳型にPCR反応が進んでしまった産物のことです。長いオリゴは効果だし品質を保つのが難しいので、例えば50bpの二本鎖DNAが欲しい時に、50ntのオリゴ２本をアニーリングする代わりに、30ntのオリゴ２本でプライマーダイマーを作らせることはあります。

(無題) 削除/引用 No.3511-9 - 2014/11/05 (水) 14:20:44 - AP あんまり垢抜けた方法ではないかもしれませんが、両末端がXhoI, NotIで切れるような配列で設計してPCRをかけてblunt-end ligatonまたはTA-cloningしてから、精製した組換えプラスミドから当該断片を切りだしたものをTagとして組込んだほうが早いかもしれません。なんか、理屈に合わない、いらん手間をかけて遠回りするようですが、こういう時は案外、

(無題) 削除/引用 No.3511-7 - 2014/11/05 (水) 14:13:22 - AP オリゴDNA（モノは同じでもプライマーとして使わなければプライマーではないですね）がアニールするとXhoIとNotIの付着末端ができて、それをそれらの酵素で二重消化したベクターに入れるという操作だという理解でよいでしょうか。 漠然としていて原因はいくらでも想像できますが（合成オリゴの品質が悪いとか、）気になるのはコロニーがひとつも生えてこなかったというところ。かなり上等な調製をしてもなんぼかはバックグラウンドとして非組換え体などのコロニーが生えるもんですが、どこかで効率をロスしていることが疑われます。ベクターはどのように調製されたものなんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3511-6 - 2014/11/05 (水) 13:44:21 - Tany 以前，わざとプライマーダイマーができるような配列を設計して，プライマーのみでPCR反応してダイマー形成させ，それをTAクローニングして組み込んだことがあります． 質問者様の目的にもよりますが，単純なクローニングならこの方法で問題なくできました．

(無題) 削除/引用 No.3511-5 - 2014/11/05 (水) 13:31:24 - 横から 横から失礼します。 私も同様にプライマーダイマーの挿入を試みています。 沸騰した水の入ったビーカーに2種類のプライマーを混ぜたチューブを入れ、室温まで下がったサンプルをライゲーションに用いました。 末端はそれぞれNot1とXho1です。 ベクターを同じ制限酵素で切断したものにVector:primer dimer＝1：1または1:10で終日冷蔵庫の中でライゲーションを行いました。 いずれにおいても大腸菌は1つも生えませんでした。 95度に温めたサーマルサイクラーに2種類のプライマーを混ぜたチューブ置き、しばらく加熱した後電源を落としまし、そのサンプルをライゲーションに用いてもだめでした。プライマーを希釈する溶液はTEになclを加えています。プライマーダイマーの長さは40ヌクレオチドです。配列はFlagで、c末端への挿入が行いたいです。うまくいかない理由としてデザインのほかに何かありますでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3511-4 - 2014/11/05 (水) 10:44:58 - み おおさん、APさん やはりそうですね。。。有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.3511-3 - 2014/11/05 (水) 09:59:36 - AP 言わずもがななことを聞いていらっしゃるような。 その上で、特にシングルダイジェストやブラントエンドライゲーションの時、如何に効率よくあたりを取るかということなら、 ・リン酸化されてない無いインサート同士は、重合する心配がないのでベクターに対して過剰量加えて、セルフライゲーションが起こりにくくする。 ・ブラントエンドライゲーションで、ライゲーション後に制限酵素認識配列が復活しない場合、セルフライゲーション産物を同じ制限酵素で切ってしまう。 ・青白選択ができる系にする。

(無題) 削除/引用 No.3511-2 - 2014/11/05 (水) 09:23:25 - おお >[Re:1] みさんは書きました : > ベクターを脱リン酸化すべきではないでしょうか？ You should not dephosphorylate it.

プライマーダイマーのサブクロ 削除/引用 No.3511-1 - 2014/11/05 (水) 08:40:30 - み 適切な組み合わせの制限酵素で開環したベクターにプライマーダイマー（末端の配列はベクター側とマッチしている）をサブクロしようと考えています。 プライマーの方にリン酸基を付加していない場合、ベクターを脱リン酸化すべきではないでしょうか？

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