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(無題) 削除/引用 No.3513-8 - 2014/11/07 (金) 23:11:20 - MH AA様 お返事ありがとうございました。 髄膜がポイントですね。次回はしっかり取って培養してみます。 また、E18-P0でも取ってみようと思います。 「大腸菌用の」ディッシュにそんな使い方があったんですね。考慮してみます。 ありがとうございました。 MH 拝

(無題) 削除/引用 No.3513-7 - 2014/11/07 (金) 20:53:13 - AA 既にご指摘のある通り、髄膜の除去が大事です。 実体顕微鏡下でしっかり取りましょう。 あとは、本培養に入る前に「大腸菌用の」ディッシュにまいて 30分ほど培養すると、接着性の高い線維芽細胞を除去することができます。 試してみても良いかと思います。 アストロは大脳から取るならE18〜P0くらいのほうが活きの良い細胞が取れる気がします。 小脳の場合はP0〜P4くらいでやりますが。

(無題) 削除/引用 No.3513-6 - 2014/11/07 (金) 10:35:35 - MH P様 お返事ありがとうございました。 論文などでP1-3からアストロサイトを初代培養すると書いてあるものが多かったため、P2でやっていました。 私はまだ研究を始めたばかりで頼る人もおらず、他の研究室にツテもありません。 論文を出している研究室に聞くという発想もなかったため、困り果ててここに投稿させていただきました。 ここでご意見を頂いても難しい場合は、系確立している研究室に問い合わせることも考えたいと思います。 中西部ポスドク様 お返事ありがとうございました。 私の大脳採取手技で髄膜の除去が不十分であった可能性が考えられ、今後試してみたいと思います。 ご専門がアストロサイトではないのに、色々と教えて頂き、ありがとうございました。 MH 拝 他に、このトピックを見た方で、ご教授いただける方がいらっしゃれば、よろしくお願い申し上げます

(無題) 削除/引用 No.3513-5 - 2014/11/07 (金) 01:25:05 - 中西部ポスドク Pさんがおっしゃるように近場であれば習うのが早いかも知れません。 大脳cortical neuronを使用目的としていた私の経験だけ書かせて頂くと、 ＞・髄膜の除去は脳をマウスから取ってきた後に大脳にはりついた膜を攝子で可及的に取り除く、という方法で良いのでしょうか ＞・脳を取ってくるときは大脳以外(小脳・嗅球・海馬など)は除去していますか 大脳を取り出して、小脳、嗅球・海馬を取り除いて、その後膜を取り除いていました。うまくいくとつるっと取れます。 ＞・DMEM-10%FBSでどれくらい継代していくとピュアなアストロサイトになりましたか 1週間強ぐらいでびっしりアストロサイトが生えて来たように思います。もちろん他の細胞もマイナーですがいると思います。ニューロンは死滅しています。接着が弱いのがmicrogliaです。 ・アストロサイトは培養何週くらいまで増殖し、何個くらいになりますか(私は１週目で１体から１０万個で約半分がアストロサイトです) こればかりは数えたことがないので、正直分からないですが、数回passage出来たと思います。数はもっと多かったと思います。 何分アストロサイトを標的にしておりませんでしたので、あいまいですみません。 誰かもう少し詳しい方の投稿を待ちたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3513-4 - 2014/11/06 (木) 21:19:14 - P こういう初代培養をするとき、使用するマウスの日齢が重要だと思うけど、P2は一般的なのかな？ ただ論文等に細胞の取り方について詳細は書かれていないと思うので、その系を確立しているラボに直接問い合わせて聞いたり習いに行った方が早いと思うよ。 primaryはなめちゃいかんぜ

(無題) 削除/引用 No.3513-3 - 2014/11/06 (木) 20:38:37 - MH 中西部ポスドク様 お返事ありがとうございました。 追加で質問させていただきたいのですが、 ・髄膜の除去は脳をマウスから取ってきた後に大脳にはりついた膜を攝子で可及的に取り除く、という方法で良いのでしょうか ・脳を取ってくるときは大脳以外(小脳・嗅球・海馬など)は除去していますか ・DMEM-10%FBSでどれくらい継代していくとピュアなアストロサイトになりましたか ・アストロサイトは培養何週くらいまで増殖し、何個くらいになりますか(私は１週目で１体から１０万個で約半分がアストロサイトです) E14のご経験でかまいませんので、ご教授いただけないでしょうか。 in vitroでの実験をあまりしていない研究室で困っており、ご多忙中のところ大変恐れ入りますが、よろしくお願い申し上げます。 MH 拝 また、このトピックを見た方で、ご教授いただける方がいらっしゃれば、よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.3513-2 - 2014/11/06 (木) 02:31:24 - 中西部ポスドク 私はE14ぐらいの胎児からPrimary neuronを取っていますが、その際髄膜をちゃんと取り除いたものをDMEM-10%FBSで飼い続けるとほぼピュアなastrocyteが取れますよ。

アストロサイト初代培養での繊維芽細胞について 削除/引用 No.3513-1 - 2014/11/05 (水) 22:02:10 - MH お世話になっております。 Ｐ２マウスの脳からアストロサイト初代培養を作成したのですが、培養7日目には繊維芽細胞が全体の4割ほどを占め、その後は繊維芽細胞がどんどん増えてくる状況になっております。 脳の採取時も気をつけているつもりですが、この状況です。 出来る限り繊維芽細胞の混入・増殖を防ぎたいのですが、初心者が陥るようなピットフォールがありますか。 そもそもアストロサイトの初代培養では繊維芽細胞がこのくらいいることは普通なのでしょうか。 ご教授いただけましたら、幸いです。 よろしくお願い申し上げます。

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