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(無題) 削除/引用 No.3546-15 - 2014/11/16 (日) 18:22:15 - 液体 >pcDNA3.1(+)を形質転換した際には12時間で大きなコロニーになります。やはりインサートが大腸菌のgrowthに好ましくないのでしょうか。 大腸菌にも足場依存性みたいのがあります。液体でよくはえない。そういった場合には、シングルコロニーを数枚ほどのプレートに広げて、充分グロースさせ、そこから菌体をかきとって、プラスミドをとることが考えられます。 昔、上の方法を示唆したところ、最初何を言っているのか分からなかったが、うまくいったと感謝されたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.3546-14 - 2014/11/15 (土) 09:23:49 - おお >-> 残りの10 ulには昨晩2 mlのLB (+Amp) に再懸濁させ（つまりバルクで培養しています）、今朝mini-prep行い、制限酵素でインサートの切り出しチェックを行うと、インサートが入っていませんでした。 バルクで扱うとこういうことはおきやすいです。なのでsingle cloneからはじめなさいというコメントがついているのです。

(無題) 削除/引用 No.3546-13 - 2014/11/15 (土) 08:57:56 - yokota >[Re:8] 774Rさんは書きました : > >もし仮に目的のプラスミドであった場合、なにかの拍子で制限酵素で切れなくなるようなことはありますでしょうか？ > > 大きくて尚且つ安定性の悪いプラスミドの場合、ミニプレップ＆制限酵素処理すると目的のバンドが出ないで正体不明なバンドが出ることはよく経験してます。 774R様のコメントのようなことが今まさに起きています。 一週間ほど前にligationを行い、すぐに形質転換をしました。 その後、LBプレート (+Amp) に生えて来たクローンをcolony PCRと平行にmini-cultureを行い、制限酵素処理して目的のインサートを確認しました。その後、シークエンスで全長を確認しました。 今、そのサンプルが手元（サンプルAとします）に僅かに残っています。 昨晩、このサンプルを再びDH5alpha (100 ul) に形質転換し、そのうち90 ulをLBプレート(+Amp) に播種し、今朝18-20時間培養してようやくコロニーを拾いました。 -> 現在mini-culture中で、増え次第、miniprep-> 制限酵素チェックでインサートの切り出し確認予定です。 -> 残りの10 ulには昨晩2 mlのLB (+Amp) に再懸濁させ（つまりバルクで培養しています）、今朝mini-prep行い、制限酵素でインサートの切り出しチェックを行うと、インサートが入っていませんでした。 ポジコンとして、サンプルAを制限酵素Not1, BamH1 in buffer 3+BSAで処理するとvector backboneとinsertが綺麗に切り出されました。 以上のことからインサートの脱落がほとんどの大腸菌内でおこっており、それを今晩行うminiprepで拾いあげるのは確率的に厳しいということになりますでしょうか？ どのようにすれば、サンプルAを増やすことができますでしょうか？ すみませんがご教示ください。

(無題) 削除/引用 No.3546-12 - 2014/11/15 (土) 08:44:21 - yokota 続けてコメントいただき大変感謝しております。ありがとうございます。 ファージ汚染について教えていただきありがとうございます。 そういうこともあるのですね。 とても気持ちの悪いことですが、私のインサートの入ったプラスミドをDH5alphaに形質転換し、12時間, 37度でLBプレートにわずかに見えるコロニー（コロニーというより、爪楊枝でプレートを極々微力で弱くつついた際に出来るくぼみほどの大きさ）が形成され、18時間で漸く0.3 mmほどの大きさのコロニーになります。DH5alphaは自作のもので、pcDNA3.1(+)を形質転換した際には12時間で大きなコロニーになります。 やはりインサートが大腸菌のgrowthに好ましくないのでしょうか。 そして「ハイスピードは使わない方がいい」というコメントをいただきましたが、同じような感覚をお持ちの方は他にもおられますでしょうか？私も前のラボではキアゲンのmidiカラムにかけ、その後イソプロ、エタチンしていました。HiSpeedは今のラボ（分子生物はそれほど得意ではなさそうです）にあったものを使用しました。 RNAの存在がカラムへのプラスミド吸着を妨害するとのコメントをいただきましたので、今後、P3を加えたあと、30分, 37℃で静置したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3546-11 - 2014/11/15 (土) 08:14:37 - mon RNaseの効きがが悪いと、plasmidのカラムへの吸着が悪くなります。 P3を加えたあと、10分~30分ほど（可能なら37℃で）放置するとよいかも。 また、LBでなくTB培地を使う時は、菌体を遠心回収後、沈殿を懸濁しないでDDWを少量加え短時間遠心して上清を捨てて（要は菌体を洗ってから）P1を加えると、失敗が少ないです。TB中の成分（リン酸？）残渣が問題なのかなと思っています。 お使いのkitによるかもしれませんが、私は菌量（培地量）を増やし、P1~P3量を増やして、37℃で保温して、（デブリ除去フィルター付きのカラムでも）遠心してデブリをあらかた除いてから、カラムにロードしています。P1~P3が足りなくなったら自作しています。plasmidによりますがカタログ値の2~3倍は調製できることが多いです。 最大量を精製したい時には、P3添加、デブリ除去（遠心＋濾紙）しEtOH沈して、少量のTEに溶かして、同量のwash bufferを加えロードすることもあります。EtOH沈で分解したRNAがそれなりに除かれるので、吸着量が増えるのだと理解しています。

(無題) 削除/引用 No.3546-10 - 2014/11/14 (金) 17:09:03 - 経験者 ハイスピードは使わない方がいいですよ。5kbくらいのベクターでも何故か精製できない（濃度が２桁）ことがあります。 何に依存しているかは不明ですが、ちゃんと遠心してエタ沈した従来のキットを使用した方が早いですよ。

(無題) 削除/引用 No.3546-9 - 2014/11/14 (金) 14:58:19 - AP ファージ汚染についてですが、 ファージは天然にもいますし、他所から入れた材料によって持ち込まれることもあります。一昔前には、IMAGEコンソーシアムで提供していたcDNAのストックが大規模に汚染されて、それが世界中の研究室に配布されてしまったということもありました。ラボが汚染すると完全にdecontaminationすることは困難で、汚染されてしまった研究室はとっても運が悪かったとしか言いようがないですが、めったに無いということではありません。だからこそ、最近では各社からファージ耐性の宿主が売られていますね。

(無題) 削除/引用 No.3546-8 - 2014/11/14 (金) 14:43:10 - 774R >もし仮に目的のプラスミドであった場合、なにかの拍子で制限酵素で切れなくなるようなことはありますでしょうか？ 大きくて尚且つ安定性の悪いプラスミドの場合、ミニプレップ＆制限酵素処理すると目的のバンドが出ないで正体不明なバンドが出ることはよく経験してます。

(無題) 削除/引用 No.3546-7 - 2014/11/14 (金) 14:19:01 - おお 解決方法はすでに上がってますが、保存中などにプラスミドが落ちたんでしょうね。 薬剤耐性でプラスミドがないのであまりいい説明がないのですが、グリセロールストックからおこすと、収量が極端にへったとか、そう言うことはけっこうおきます。

(無題) 削除/引用 No.3546-6 - 2014/11/14 (金) 14:15:28 - yokota みなさま大変有益なコメントをいただきありがとうございます。 はい、-80度で保存してあったグリセロールストックをplatingをせず、そのままAmpの入ったLB培地100 mlに入れました。thawした後50 ulほどを入れて6時間という短時間での培養でおこなって、結果プラスミドが取れませんでした。 ありがとうございます。ローコピーが疑われれば、温度を下げるというのはここの過去のトピックでありました。 シークエンスに出したミニプレップ産物が残っていますので、再度transformationからやりなおし、シングルコロニーを拾うことにします。その後制限酵素で改めて確認した後、温度を下げて取ってみます。 ファージに感染というのはよく起こりえるものなのでしょうか？例えばラボがファージを扱うようなラボで無い限り、起こりえないのか、それとも一般的に空気中を浮遊しているようなものなのでしょうか。 もう一点気になる点があります。 カラムを使わず、培養液2 mlでマニュアルでP1, P2, P3後にイソプロチン/エタチンすると確かに終えレットが見えます。それを電気泳動すると不思議な事にシークエンスに出した産物と同じところ（かなり高分子量領域ですが）に出ます。それなのに、2つの制限酵素でカットすると今回マニュアルで回収したサンプルからインサートが切り出されないということで、このサンプルが目的のプラスミドなのかそうでなくて酵母などのゲノムとかなのか判断ができません。 もし仮に目的のプラスミドであった場合、なにかの拍子で制限酵素で切れなくなるようなことはありますでしょうか？pcDNA3.1にインサートを入れた物をDH5alphaに形質転換したものなのですが、これまで遭遇したことのない事態で困惑してしまいました。 質問で返してしまい大変恐縮しています。お手透きの際で結構ですのでコメントをいただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3546-5 - 2014/11/14 (金) 13:52:56 - AP すでに指摘のあるように、ストリーキングしてシングルコロニーをとるのが基本だと思いますが、そうしないでグリセロールストックの一部をそのまま培地にいれているのですか？ グリセロールストックは、定常状態まで培養した培養液にグリセロールを加えて作るのが普通だと思いますが、アンピシリン耐性選択だとその時点でβラクタマーゼがタップリと培養上清に含まれているかもしれません。また、アンピシリン力価が下がってきていてプラスミドを失った細胞も生じてきている状態でグリセロールストックにしていたかもしれません。 シングルコロニーをとらないでグリセロールストックを直接接種すると、 ・その時点で、プラスミドを失った細胞がかなり混じっているのかもしれない ・グリセロールストックの上清中にすでに分泌されたβラクタマーゼが存在していて、すぐにアンピシリンの力価を弱めているかもしれない 結果として、プラスミドを持たない細胞が優占的に増殖したのかもしれません。 もっとも、グリセロールストックを起こすとき、シングルコロニーをとってもそんなふうになることはあります。例えば、ファージに汚染されたとか。

(無題) 削除/引用 No.3546-4 - 2014/11/14 (金) 13:16:00 - yyy -80Cで保存したというのはグリセロールストックですか？ その後にthawした後の培養では十分量のアンピシリンが入っていたのでしょうか？ 大腸菌を冷凍保存中にプラスミドを失ってしまったらしいというのはよく聞くし、自分でもそれらしいことを経験したことがあります。実際、ネットで検索しても同じような問題に関する質問は複数出てきます。 もしプラスミドがあるなら、それで改めてtransformしてAmpRを拾えば、普通は問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.3546-3 - 2014/11/14 (金) 13:11:28 - さく 大腸菌をシングルコロニーアイソレーションする。

(無題) 削除/引用 No.3546-2 - 2014/11/14 (金) 12:52:08 - TK-1 ３０度培養。

10kのプラスミドがHiSpeed Plasmid Midiで回収出来ない？ 削除/引用 No.3546-1 - 2014/11/14 (金) 12:14:05 - yokota お世話になります。 大腸菌のコロニーを楊枝でつつき、それをコロニーPCRをやりつつ、mini-cultureをしてminiprep後の産物を制限酵素カットし、目的のインサートが入っていることが確認できた大腸菌コロニーがあります。 シーケンスをするためにその大腸菌を一時的に-80℃ストックし、インサートの全長のシーケンスが確認できたので、改めて一部thawしたものをmini^midi cultureしました。 標題のキットにていつも通りに精製を試みたのですが、100 ml培養液（over growthではないです。）から0.5 micro-gという目を疑う量しか回収されませんでした。 再度thawからmini^midi cultureと行いましたが、同様の結果でした。 さらに100 mlの培養液の一部 (2 ml) を取り、P1, P2, P3と処理し、エタチンで遠心すると確かにペレットは見えたのですが、やけにペレットが白く、表現の仕方が難しいですが、エタノールwash中にペ レットを懸濁しようとするといつも扱うプラスミドのような印象を持てませんでした。ペレットが脆いというか。。 制限酵素処理でインサートを確認し、それをシークエンスに出したサンプル（mini-prep）が一部残っていますが、これを再度DH5alphaの形質転換し、ampRを取ればレスキューできますでしょうか？ 酵母のコンタミが大腸菌ストック内にあったとした場合、改めて形質転換からやり直す事で一般にレスキューは可能でしょうか？ようやくライゲーションが上手くいって喜んでいたので、再度始めからPCRとなると辛いです。 このような経験をお持ちの方、原因や、対処法をシェアしていただけませんでしょうか？ どうぞよろしくお願い致します。

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