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(無題) 削除/引用 No.3558-12 - 2014/11/21 (金) 20:58:59 - ビストロ お返事遅くなり申し訳ありません、皆様のアドバイス大変有り難く思います。 TE bufferのみで同様の実験を行ったところ、細胞はプラスミド入りの時よりも明らかに生存してましたので、プラスミド溶解液には問題なかったようです。 プラスミドの吸光度における純度は下記のようになってますので、この点は問題ないと思います。電気泳動は来週以降に行う予定です。 OD260/280 : 1.95 OD260/230 : 2.39 細胞については皆様のおっしゃる通りストックを起こし直した方が懸命だと思いましたので、さっそくその細胞で検討してみたいと思います。 SVさん 添加したプラスミドの量はNeonやlipofectamineのプロトコールに従ってはおります。GFPのcotransfectionについてはさっそく相談してみたいと思います。 おおさん キットのプロトコールとは別にさらに精製の過程を挟むということですかね。 他の原因を検討して、プラスミドを再度精製する必要になった場合はそのようにさせて頂きたいと思います。 ketさん 情報ありがとうございます。上のリンクはDNAではアポトーシスが起きるとのことですが、私の細胞でアポトーシスが起きているのかは確認していません。ただ、顕微鏡の見た目では核と思われる部分に変化が起きていて、最終的には弾けているような細胞もいます。私自身がまだ細胞培養の経験が浅いため、その変化がアポトーシスなのかが判別できませんが。。。 asanさん おっしゃる通り細胞やプラスミドを改めて新しくするのが早いと思います。プラスミドは新しく精製したものを用いても細胞が死んでしまったので、とりあえず細胞に原因がある可能性をみるために起こし直しを行いたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3558-11 - 2014/11/19 (水) 14:29:38 - asan かなりDNAを汚くとっても通常の細胞だったら2日で100%死ぬってのはちょっと考えにくいですね。こういう場合は、可能性は無数にあるので、コントロール（上手くいっているサンプル）などと比較していってどこに問題が有るか順だってトラブルシュートしていかないといつまでたっても解決できませんし、きりがありません。 トランスフェクションに限らず場合によっては、思い切って全て（細胞を起こし直す、トランスフェクション溶媒、培地、DNA等全て）を全部新しく調製したものでやってみるとかが急がば回れだったりもして案外早いということもあります。時間と試薬調製のコストに難がなければそれも視野に入れても良いでしょう。 まあ、端的にこれまでの結果から考えられるのはDNAの希釈溶液が汚いかあるいは溶液を間違えて毒性のあるものを使用していたとかでしょうか？とりあえずラボの他人が上手くいっているプラスミド溶液が有るならそれでコントロールを取ってみるとかが良いかもしれません。 細胞の状態が悪いという可能性も否定は出来ないので、余裕が有ればとりあえずさっさと起こし直しもしてみればいいでしょう。 精製したDNAはODとかをしっかり測って純度は確認したんですよね？有機溶媒なんかで間違えて希釈したなら230とかが異常に高く出たりするので分かると思います。あと、J774以外の293Tなんかでも死ぬのか細胞特異的なのかとかも見ておくと良いでしょう。293Tなんかだと、アルカリプレップしたかなり汚めのやつをトランスフェクションしても100%死ぬことは基本的にはないです。

(無題) 削除/引用 No.3558-10 - 2014/11/18 (火) 12:48:26 - ket www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15629470 www.tabaslab.com/protocols/Fugene%20HD.pdf 細胞が気難しそうな印象。

(無題) 削除/引用 No.3558-9 - 2014/11/18 (火) 09:48:57 - おお >[Re:7] ビストロさんは書きました : > > また、RNAについては大腸菌のアルカリ処理の直前にRNase処理の行程が含まれているようです。 まあそれを知った上でかいているんですけどね。

(無題) 削除/引用 No.3558-8 - 2014/11/18 (火) 08:20:59 - SV プラスミドの量はどのくらいの入れてますか？ たくさんいれる人がいますが、多すぎると死んでしまいます。 小生もGFPでcotransfectionをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.3558-7 - 2014/11/18 (火) 07:56:13 - ビストロ 皆様お返事ありがとうございます サンショウウオさん こちらも無知でしたので、ご指摘ありがとうございます やり方を調べてご報告できればと思います yyyさん プラスミドのelution後は、イソプロ沈殿後にエタノール洗浄し、最終的にはTEバッファーで溶解していますので、影響があるとしたらそのTEバッファーですかね。。。 プラスミドなしのバッファーのみを加えて検討したいと思います 件の経験者からはプラスミドを借りるのは、バッファーのみの結果を受けて相談したいと考えています おおさん マイコプラズマの感染は確認する必要があるかもしれません。。。 早急に検討したいと思います。 ちなみにLPSなしのものもコントロールでとりましたが、同様に細胞が死んでいました。 また、RNAについては大腸菌のアルカリ処理の直前にRNase処理の行程が含まれているようです。

(無題) 削除/引用 No.3558-6 - 2014/11/18 (火) 01:46:02 - おお 細胞のほうは疑う余地がないでしょうか。マイコプラズマとかオーバーコンフになっているとか。LPSで増殖も刺激されると思うし、、、ところでLPSなしのコントロールはとってないのでしょうか、とってたとして、どんな感じでしょうか。 transfection自身の評価はGFPなどcotransfectionして蛍光でどの程度はいっているかはみれるとおもいます。 キットなんでまずそんなことはないかとは思いますが、RNAが混入してたらどうだろう。。。RNAにかぎらず1ステップ精製をかましてみるのは手かとなんとなく思いますが。RNAとかだったら、RNase処理、PEG沈かな。

(無題) 削除/引用 No.3558-5 - 2014/11/18 (火) 00:32:15 - yyy プラスミドのelution bufferとかに問題がないですか？ プラスミドも抜きで、同量のelution bufferを細胞に加えてみる、というのはもう試されたでしょうか？ 件の「経験者」さんからプラスミドを借りて、プラスミドだけ加えても問題はないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3558-4 - 2014/11/17 (月) 21:10:09 - サンショウウオ 　すいません書き間違えました。 　×PCR 　○制限酵素処理後と前のサンプルのアガロースゲル電気泳動でプラスミドが環状か同課の確認（バラバラのDNAになっていても細胞死を引き起こすほどの刺激になるのか疑問ですが。） LPSは多糖でJ774を刺激したんですね。（知らなかった。。。。 　うーん、うちでもQiagenのMiniとMidiの精製キット使ってて、問題は出たことないんだけど、J774に使ったことは経験は無いです。そんなに精製時に混入するエンドトキシン影響でるのかな?

(無題) 削除/引用 No.3558-3 - 2014/11/17 (月) 20:55:35 - ビストロ オオサンショウウオさん お返事ありがとうございます ご指摘のPCRによるプラスミドの確認はしてません。 プラスミドが原因で細胞が死ぬのではと疑い、先週プラスミドを再度精製してまずは細胞死が起こるのか起こらないかを検討しました。 PCRによる確認を早速検討したいと思います。 LPSはグラム陰性菌の菌体成分でして、J774細胞を活性化させてサイトカインを産生させます。エンドトキシンとも言います。 プラスミド精製キットはホームページ見た限りではエンドトキシンの混入は低く抑えられているとありますが、得られたプラスミド中にあるのかは測定してないです。

プラスミドだけで？ 削除/引用 No.3558-2 - 2014/11/17 (月) 20:10:13 - サンショウウオ プラスミドだけ添加して全滅となると、、、、、プラスミド溶液になんか入ってるんだろうか?PCRでプラスミドが環状になっていることは確認されてますか?　さすがにアルコールとかの残留はないと思うけど。 　それともLPSのせいかな？（LPSってなんですか?） 　Lipofectamineの新しい方の（２tubeつかって短時間でやるやり方）やり方だと、（新旧ともにOpeiMEM中でリポソームの形成させてから、DMEM（血清有）にトランスフェクション試薬を添加するようにしてます。）接着細胞がよくはがれる印象がありますが、全滅したことは無いなぁ。。。。。

トランスフェクションの操作で過剰に細胞が死ぬ 削除/引用 No.3558-1 - 2014/11/17 (月) 19:58:12 - ビストロ トランスフェクション時のトラブルです。 当方はトランスフェクション初心者です。 J774.1細胞に対してNFκB-lucの導入を検討しています。 大腸菌で増幅させたプラスミドDNAを用いてlipofectamineやエレクトロポレーションでトランスフェクションし、36時間後にLPSを添加、さらに12時間後にプロメガのキットで発光を検出しています。 いずれの結果もブランク値とほとんど変わらず、導入ができていないと考えています。 トランスフェクションから48時間後の細胞を顕微鏡で観察したところ、通常の細胞と比較して核がでこぼこしていたり、はじけてしまっているような細胞がいたりしています。 トランスフェクションによる細胞へのダメージなのか、プラスミドによるものなのかを確かめるために、トランスフェクション操作をせずにプラスミドだけを培養液に添加して48時間後の細胞をトリパンブルーで染めたらほとんどすべての細胞が染まっており、全滅していました。 プラスミドの精製は経験者とともにキアゲンのキットで行いましたが、その経験者はそのようなトラブルは経験したことがないそうです。 このままではアッセイが進まず、大変困っています。 初心者でわからないことが多いのですが、些細なアドバイスでもいただけると幸いです。

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