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(無題) 削除/引用 No.3560-9 - 2014/11/25 (火) 13:49:10 - おお >[Re:8] 安定発現さんは書きました : > 確かに、遺伝子が十分強度に発現していないとアッセイを行うのは危険ですね。薬剤を効かせるとして、遺伝子導入前の細胞は薬剤なしで比較してよいのでしょうか。 それはしない方がいいでしょう。

勉強になります 削除/引用 No.3560-8 - 2014/11/25 (火) 09:42:59 - 安定発現 ■おお様 お返事ありがとうございます。 ＞発現レベルでなくなっていくので遺伝子が落ちる 確かに、何も入れないと発現は弱くなっていく感じはあります。 ＞あなたが考えているアッセイで遺伝子の影響が見られなくなってしまう可能性はないでしょうか。 確かに、遺伝子が十分強度に発現していないとアッセイを行うのは危険ですね。薬剤を効かせるとして、遺伝子導入前の細胞は薬剤なしで比較してよいのでしょうか。薬剤の影響を指摘されそうな気がします。 ■mon様 ご紹介ありがとうございます。紹介していただいたいずれかのキットの使用も検討してみます。バイシストロニックバージョンもあって魅力的です。 Tet-ON advancedのほうが安いくていいですね。 このシステムで強制発現をさせる場合、内因性のものと導入後のものを区別するには、タグをつけておけばいいのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3560-7 - 2014/11/22 (土) 20:06:27 - mon ＞もしよろしければ、そのお勧めのシステムのご紹介をいただけますでしょうか。 InvitrogenのTRex systemを使用していますが、導入細胞をクローニングしないと非誘導時にもある程度発現します。 細胞をクローニングすればよいかもしれません。 使用経験はないですが、TAKARAのTetON 3Gが良さそうです。レンチウィルス系はなくレトロウィルス系で一つ前のTetON Advanceがあります（しかし高価！）。リプレッサーのtTS遺伝子も導入しておくと非誘導時の発現を抑制できるので、良さそう。

(無題) 削除/引用 No.3560-6 - 2014/11/20 (木) 10:27:20 - おお >[Re:5] 安定発現さんは書きました : > 皆様ご回答ありがとうございます。 > >それでも落ちるときは落ちるでしょうけど、大腸菌のプラスミドがなくなるといった感覚ではありません。 > この、それでも落ちるというのはどうやって脱落していくのでしょうか。 発現レベルでなくなっていくので遺伝子が落ちるとまあいってますが、具体的にどうなるかについては原因を探ったことはありません。 > > >その細胞増殖は親株とくらべて遅いですか? > はい遅いです。セレクション培地を抜いて、しばらくすると増殖速度は回復してきますが、蛍光マーカーの発現が弱くなっています。 これが顕著であれば、あなたが考えているアッセイで遺伝子の影響が見られなくなってしまう可能性はないでしょうか。そう言った意味でこれをセレクションの薬剤が必要かどうかの判断材料にすればいいかと思ったのです。

ありがとうございます 削除/引用 No.3560-5 - 2014/11/20 (木) 10:11:43 - 安定発現 皆様ご回答ありがとうございます。 ■おお様 どちらでもいいのですね、ありがとうございます。論文によってまちまちだったり、記載されていなかったりして、どうなんだろうと思っていましたがご回答をいただけて少し安心しました。 >それでも落ちるときは落ちるでしょうけど、大腸菌のプラスミドがなくなるといった感覚ではありません。 この、それでも落ちるというのはどうやって脱落していくのでしょうか。 遺伝子をいれたものが死滅していて、偶然遺伝子を落とした集団がその代わりに増えていっているという感じなのでしょうか。 実際観察しているうちに実感としてあるのは、セレクション培地を入れていないと、目的遺伝子とバイシストロニックに発現している蛍光マーカーそのものの発現が弱くなってしまうという感じです。セレクション培地を入れていると、蛍光の発現は強いです。 >その細胞増殖は親株とくらべて遅いですか? はい遅いです。セレクション培地を抜いて、しばらくすると増殖速度は回復してきますが、蛍光マーカーの発現が弱くなっています。 ■mon様 >しかし、脱落した細胞＝野生型に戻っている細胞があれば、アッセイ結果＝野生型との差が小さくなることが予想されます。 分かりました、両方試してみることにします。野生型との差が小さいようであれば、セレクション培地を入れてみます。 >さらに、レンチウィルス等の誘導発現型ベクターで薬剤耐性細胞集団（50クローン以上のMix)を調製し、クローン化しないで〜 もしよろしければ、そのお勧めのシステムのご紹介をいただけますでしょうか。よろしくお願いいたします。時間がものすごくかかったので、次回はそちらの方法も検討してみようと思います。 ■qw様 ＞薬剤耐性遺伝子だけを導入した細胞も用意できるのでしょうか？ それが、今回用意できていないのです。なので、野生株と遺伝子導入株を比較するときに、抗生物質の影響が懸念されますので、できれば抗生物質を抜いて野生型と遺伝子導入細胞の両方を比較したいのですが、遺伝子の脱落が心配なのと、差があまりないようでしたら、mockコントロールを置いたほうがよいかもしれません。 そのあたりは色々と試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3560-4 - 2014/11/18 (火) 21:28:12 - qw 薬剤耐性遺伝子だけを導入した細胞も用意できるのでしょうか？ そうでなければ、遺伝子導入した細胞株だけ薬剤を添加し、親株の方は薬剤無しで測定することになりますね。そちらのほうが問題かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3560-3 - 2014/11/18 (火) 14:47:44 - mon 各アッセイ中に導入遺伝子の脱落がなければ、選択用抗生剤は不要でしょう。 しかし、脱落した細胞＝野生型に戻っている細胞があれば、アッセイ結果＝野生型との差が小さくなることが予想されます。それでも差が有意であればよいのですが。 ご自身で確かめるしかないです。 「遺伝子が脱落しやすい状態」とお考えなら選択培地の方が無難ですが、選択培地と通常培地で同時にやってみるのも手です。 可能ならコントロールは目的遺伝子の入っていない薬剤耐性細胞と導入していない親株の両方がよいですね。 なお、クローン毎にかなり性質が異なることがありますので、１クローンだけでの実験で仮説の証明は難しいです。 さて、安定発現細胞の樹立が大変だったと思います。 このような安定発現細胞がとれづらい（と予想される）場合、誘導発現型ベクターを利用し、同じ細胞で発現のOn-Offで比較する手法も汎用されます。これなら数少ないクローンの実験で信憑性が高くなります。 さらに、レンチウィルス等の誘導発現型ベクターで薬剤耐性細胞集団（50クローン以上のMix)を調製し、クローン化しないで（できればあまり継代しないで）アッセイする手法も多用されています。

(無題) 削除/引用 No.3560-2 - 2014/11/18 (火) 14:37:12 - おお そう言うのは個々の事例で変わってくるかもしれませんなので、軽率な発言はさけたいですが、あえてそれでもいうなら、どっちでもいいです。入れておいたほうが無難ではあります。 安定導入されていますから、染色体にインテグレートされているでしょうし。それでも落ちるときは落ちるでしょうけど、大腸菌のプラスミドがなくなるといった感覚ではありません。 その細胞増殖は親株とくらべて遅いですか?遅いとして、通常の培養でマーカーの薬剤を抜いて増殖スピードが2、3回のけいだいでもとにもどりますか?

安定発現株樹立後のアッセイの培地 削除/引用 No.3560-1 - 2014/11/18 (火) 13:36:57 - 安定発現 いつも勉強させていただいております。 プラスミドをリポフェクションでヒト腫瘍細胞株にトランスフェクションし、セレクション後、安定発現細胞株のクローンを樹立しました。 数ヶ月のセレクションに耐え、ウェスタンブロットにて目的タンパク質の発現を確認しております。 腫瘍増殖抑制効果のある遺伝子のプラスミドを導入したため非常に死滅しやすく、遺伝子が脱落しやすい状態です。 この状態でソフトアガーコロニーフォーメーションアッセイと細胞増殖アッセイを行おうと考えています。 このとき、培地にはセレクション培地を使うべきでしょうか。 それとも、通常の培地でよいのでしょうか。 ご教授いただければ幸いです。

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